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从丹顶草地上部分中分离得到具有抗炎活性的化合物
作者从丹顶草地上部分分离得到一种新的megastigmane糖苷(1)，以及13种已知的化合物(2-14)，并评价了其抗炎活性。
取丹顶草地上部分(3.0 kg)，用甲醇回流提取，得到甲醇粗提物(290 g)，将甲醇粗提物悬浮于热水中，用正己烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇依次分配层析，分别得到正己烷提取物(39.5 g)、三氯甲烷提取物(3.2 g)、乙酸乙酯提取物(53.8 g)、正丁醇提取物(67.2 g)。三氯甲烷部分经硅胶柱色谱分离，用正己烷／乙酸乙酯梯度洗脱，得到8个部分(F1-F8)，部分F4(430.0 mg)经硅胶柱色谱分离，用三氯甲烷／乙酸乙酯梯度洗脱，得到化合物3(3.4 mg)和7(50.0 mg)。部分F6(280 mg)经硅胶柱色谱分离，用三氯甲烷／乙酸乙酯梯度洗脱，得到6个部分(F6.1-F6.6)。部分F6.2(55.6 mg)经硅胶柱色谱分离，用三氯甲烷／甲醇梯度洗脱，得到化合物4(7.0 mg)和5(7.2 mg)。部分F6.4(18 mg)结晶后，用三氯甲烷／甲醇洗脱，得到化合物6(7.1 mg)。乙酸乙酯部分(53.8 g)，经硅胶柱色谱分离，用三氯甲烷／甲醇／水梯度洗脱，得到9个部分(E1-E9)。部分E3(3.5 g)经RP-C18硅胶柱色谱分离，用甲醇／水梯度洗脱，得到10个部分(E3.1-E3.10)。部分E3.4(72.0 mg)经 RP-C18硅胶柱色谱分离，经乙腈／水梯度洗脱，得到化合物1(15.0 mg)和8(25.0 mg)。部分E3.6(85.0 mg)经HPLC分离，用甲醇／水梯度洗脱，得到化合物9(8.0 mg， tR＝29.8 min)，10(3.4 mg，tR＝42.6 min)和11(7.1 mg， tR＝51.3 min)。部分E8(2.2 g)经RP-C18硅胶柱色谱分离，用乙腈／水梯度洗脱，得到8个部分(E8.1-E8.8)。部分E8.4(65.0 mg)经RP-C18硅胶柱色谱分离，用甲醇／水梯度洗脱，得到化合物12(20.0 mg)和14(10.8 mg)。E8.6(45.0 mg)经结晶得到化合物2。E8.5(48.0 mg)经RP-C18硅胶柱色谱分离，用乙腈／水梯度洗脱，得到化合物13(32.0 mg)。 -
小鼠铁调素1功能肽Hepc25的表达及纯化
目的 利用原核生物表达载体表达小鼠铁调素功能肽Hepc25,并对其进行纯化. 方法 选取编码25aa的Hepc25基因与硫氧还蛋白基因融合后在大肠杆菌中大规模诱导表达该融合蛋白,以RT-PCR法扩增小鼠Hepcidin1功能肽基因Hepc25,将目的基因克隆到原核表达载体pET-32a(+)中获得pET-32a-Hepc25,再以pET-32a-Hepc25转化大肠杆菌BL21表达融合蛋白,收集菌体蛋白,用Western blotting和SDS-PAGE法检测融合蛋白,优化融合蛋白高表达条件.依次利用亲和层析、离子交换层析和凝胶排阻层析法纯化融合蛋白,融合蛋白经肠激酶酶切、高效液相色谱法(HPLC)分离纯化获得了目的蛋白Hepc25. 结果 成功构建了小鼠pET-32a-Hepc25融合蛋白表达载体,融合蛋白表达量约占大肠杆菌BL21总蛋白量的28％,融合蛋白在33℃、120r/min、终浓度为0.2mmol/L的异丙基-13-D硫化半乳庶糖(IPTG)诱导8h的条件下表达量高,融合蛋白纯度达95％.融合蛋白经过色谱分离、酶切和HPLC分析,目的蛋白的纯度也达95％以上. 结论 利用原核生物表达载体成功表达并纯化了小鼠铁调素功能肽Hepc25,并筛选出了高表达的优化条件.
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美洲大蠊主要变应原的纯化与免疫学鉴定
为利用蛋白纯化技术获得较高纯度美洲大蠊天然主要变应原,以进一步提高临床诊断的特异性和免疫治疗疗效.美洲大蠊全虫粗浸液通过DE-52离子交换层析、Hiprep Sephacryl(R) S-200凝胶过滤层析等分离步骤得到了纯度为90%的目的蛋白,回收率为26%,经Western Blotting分析74kDa的蛋白质具有免疫原性,为变应原疫苗的纯化和标准化奠定了基础.
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免疫金层析试验快速检测血清HBsAg
免疫金层析试验是20世纪90年代初在免疫渗滤技术[1]的基础上建立的一种快速简便的免疫检测技术.
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中华眼镜蛇α-神经毒的纯化及其在烟碱型乙酰胆碱受体纯化上的应用
目的 从中华眼镜蛇粗毒中分离纯化其α-神经毒组分,并将此α-神经毒作为亲和层析的配基纯化烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR).方法 采用凝胶过滤层析、阳离子交换层析逐步分离纯化中华眼镜蛇粗毒,通过125Ⅰ-α-银环蛇毒素(αBtx)-nAChR结合抑制实验检测蛋白活性、SDS-PAGE检测蛋白的相对分子质量和纯度；亲和层析纯化nAChR,放射免疫沉淀法测nAChR活性.结果 从5g中华眼镜蛇粗毒中共纯化得到约20 mg眼镜蛇α-神经毒,该眼镜蛇α-神经毒有一定的125Ⅰ-αBtx-nAChR结合抑制活性,其半数抑制浓度(IC50)约为αBtx的28倍.以纯化的α-神经毒制备的亲和介质,可吸附大鼠骨骼肌肌膜提取物中约84％的125Ⅰ-αBtx结合活性,且此活性可以被0.2 mol/L卡巴胆碱洗脱.结论 用简单的液相色谱方法可从中华眼镜蛇毒中分离纯化α-神经毒,并且可以以其为配体从大鼠骨骼肌中纯化nAChR.
关键词： 眼镜蛇神经毒素蛋白质类 受体 层析 -
DoE实验设计开发23价肺炎多糖疫苗层析纯化平台工艺
目的:应用DoE实验设计,建立一种新型23价肺炎多糖疫苗层析纯化工艺平台.方法:将23F型肺炎粗糖样品作为开发样品溶解并预处理后,采用DoE设计开发基于Capto Adhere的纯化工艺.色谱纯化过程采用流穿模式,通过DoE分析获得工艺参数,在该条件下将多糖和其他杂质分离,并作为纯化平台应用于其他血清型多糖.根据《欧洲药典》7.0的方法和标准,对样品的各项指标进行检测.结果:23F型多糖在柱上流穿,多糖与蛋白和核酸完全分离,应用此工艺平台至其他血清型多糖上,纯化的多糖样品各项指标也均符合《欧洲药典》7.0的标准.结论:通过DoE实验设计快速建立了一种新型肺炎多糖疫苗层析纯化工艺平台,缩短生产时间,提高产品质量,代替传统的有毒苯酚抽提工艺,可用于23价肺炎多糖纯化和23价肺炎多糖疫苗生产.
关键词： 肺炎多糖 层析 Capto Adhere 疫苗 DoE -
同一种方法鉴别三种氨基糖苷类抗生素
硫酸庆大霉素注射液、硫酸阿米卡星注射液和硫酸西索米星注射液是临床上常用的氨基糖苷类抗生素.<中国药典>2000年版二部收载了这3种注射抗生素,其鉴别方法均采用薄层色谱法,其展开条件和展开后显色方法各不相同.笔者在检验中发现,硫酸阿米卡星制剂按<中国药典>收载的方法薄层色谱,层析结果并不理想,供试品与标准品所显的主斑点Rf值明显偏小,拖尾严重,展开时间过长(约2～3h),点样量过大,造成主斑点过大,不够集中.经反复试验筛选,试用展开剂由氯仿-甲醇-浓氨-水(1:4:2:1)改为氯仿-甲醇-浓氨-丙酮(10:10:8:3),固定相用硅胶G代替硅胶H铺薄层板,收到了很好的效果,并用于硫酸庆大霉素注射液和硫酸西索米星注射液的鉴别,这样在同一薄层板上,用同一层析缸可同时鉴别3种不同的抗生素.
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高效液相层析法检查β地中海贫血应用评价
目的对高效液相层析法快速筛查β地中海贫血进行评价.方法用高效液相层析法测定血中血红蛋白A2(HbA2)、血红蛋白F(HbF)的含量,并与抗碱变试验法测得HbF、琼脂糖电泳法测得HbA2的含量进行比较;取低、中、高三种浓度值的标本进行重复性试验;在HbF含量为3.5%、5.7%和HbA2含量为5.9%、7.7%的两份标本中加入不同浓度的胆红素液及脂肪乳作干扰试验;与已知HbF浓度为33.0%和1.1%的两份标本按不同比例混合,分别进行测定,观察该法测定的线性范围.结果该法测定HbF与抗碱变试验法结果相符、HbA2与琼脂糖电泳法有良好相关(r=0.8656);HbF的线性范围可达33%;HbF和HbA2批内变异系数分别为1.5%～3.4%和3.7%～5.9%,批间变异系数分别为1.9%～4.2%和4.9%～7.5%;胆红素浓度在250μmol/L,甘油三酯浓度在22mmol/L以下时对测定结果无影响.结论高效液相层析法测定HbF和HbA2具有准确度高,重复性好,不受脂浊、黄胆标本的干扰,且检测速度快,对β地中海贫血具有较好的初筛作用.
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光学相干断层的临床应用及前景
随着激光技术、超快激光技术、X线计算机层析和磁共振成像技术的不断发展,已形成了一门新兴的断层扫描成像技术--光学相干断层(optical coherence tomography,OCT).这一技术的应用不仅可获得微米量级的空间分辨率,还可给出较高的动态时间分辨图像,且造价低、易操作,故具有广泛的实用意义.本文就其临床应用前景及与现有成像技术的比较作一综述.
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粉防己中非酚性生物碱的提取与分离
粉防己是防己科千金藤植物粉防己Stephania tetrandra S.Moore的根,含有粉防己碱、粉防己诺林碱、轮环藤酚碱,具有解热镇痛、风湿止痛、利尿消肿之功效.本实验对粉防己总碱中非酚性碱进行了研究,采用Al2O3层析方法正向分离非酚性粉防己碱与粉防己诺林碱,得到较好的结果.
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新型层析反求测量系统牙颌建模的应用研究
目的 对新型层析反求测量系统的断层图像获取及定位精度等进行评估,并进行上下牙颌的建模应用.方法 使用新型层析反求测量系统获取同心圆测量标定板图像,通过5次模拟层析及图像获取过程,测量圆心及四个不同方向的圆形半径变化,分析图像变形率,评估图像重复定位精度.并应用该系统对具有咬合关系的上下颌牙列模型进行逐层切削,数据运算,重建牙颌数字模型.结果 新型层析测量系统各个方向上5次测量结果间无统计学差异P＞0.05,在距离上测量结果存在显著性差异P＜0.05,Student-Newman-Keuls两两对比统计发现,5mm到25mm距离变形差异不显著P＞0.05,25mm和30mm时距离变形有统计学差异.重复定位测量表明,大误差小于0.026mm.通过层析测量数据,可以建立具有咬合关系的牙颌数字模型.结论 新型层析反求测量系统具有较高的图像获取及定位精度,能够适用于口腔牙颌的三维建模.
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人胃蛋白酶原Ⅰ、Ⅱ的分离纯化
目的：用放射免疫方法测定血清中胃蛋白酶原。方法：从人胃粘膜分离纯化胃蛋白酶原Ⅰ、Ⅱ，采用DEAE-Sephadex A25离子交换层析和Sephadex G100凝胶过滤层析方法纯化胃蛋白酶原Ⅰ、Ⅱ。结果：纯化的胃蛋白酶原经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳证明一条带，分子量为41 kd、40 kd。结论：用二次层析法可以纯化人胃蛋白酶原Ⅰ、Ⅱ。
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生殖细胞膜脂筏中精原糖脂质的分离纯化及初步鉴定
目的 哺乳动物的硫酸化糖脂质由负电荷硫酸离子和两亲性的鞘糖脂组成,硫酸盐半乳糖神经酰胺的硫酸糖脂质和硫酸盐半乳糖烷基甘油酯的精原糖脂质是存在与哺乳动物的两种主要糖脂质,为验证它是否以脂筏形式存在于生殖细胞膜上,提纯生殖细胞的精原糖脂质及其脂筏.方法 应用DEAE-Sephadex A-25和硅胶交替层析法,提纯牛的睾丸中精原糖脂质;在裂解缓冲液下应用匀浆机裂解生殖细胞,在5%～40%的蔗糖密度梯度离心下,提取生殖细胞中的脂筏;在氯仿/甲醇/水=10/20/1溶剂下分离脂筏的脂类和蛋白质,经薄层层析(TLC)和蛋白电泳(SDS-PACE)检测精原糖脂质存在方式.结果 经离子交换层析和硅胶层析,获得高纯度的精原糖脂质;经蔗糖梯度离心,在离心管中可见的脂筏两条带被回收,经薄层层析(TLC)检验,精原糖脂质存在于生殖细胞膜脂筏中.结论 由此推测精原糖脂质在生殖细胞细胞膜内,作为一个为受体信号传导和运输的功能性平台,并作为脂筏的组成部分而发挥关键作用.
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重组Thermomonospora fusca纤维素酶Cel6A在毕赤酵母中的表达及纯化
目的 在毕赤酵母中表达Thermomonospora fusca纤维素酶Cel6A.方法 提取Thermomonospora fusca基因组DNA作模板,PCR扩增纤维素酶Cel6A基因,克隆到毕赤酵母表达载体pGAPZαA上,用电击法将线性Cel6A-pGAPZαA核酸片段转化毕赤酵母X-33株,克隆PCR鉴定法筛选阳性转化株,培养传代.选择稳定株,培养3 d后取培养液上清,用His-Bind Quick Cartridge 300提取表达的重组Thermomonospora fusca纤维素酶Cel6A.结果 一步His-Bind Quick Cartridge 300层析可提取电泳纯的重组Thermomonospora fusca纤维素酶Cel6A,SDS-PAGE分析显示相对分子质量约为60 000,收率为200mg/L,用羧甲基纤维素法测活性为500 U/mg,用滤纸法测活性为1 U/mg.结论 已在毕赤酵母中成功表达了Thermomonospora fusca纤维素酶Cel6A.
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层析技术制备马抗中东呼吸综合征冠状病毒F(ab')2
目的 采用层析技术制备高纯度的马抗中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrom coronavirus,MERS-CoV)F(ab')2.方法 以MERS-CoV病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)对马匹进行多次免疫所制备的高免血清为原料,采用亲和层析技术提取血清IgG,经胃蛋白酶酶切后,通过阴离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析分别对F(ab')2进行纯化;以MERS假病毒检测所制备的IgG与F(ab')2中和活性.结果 凝胶过滤层析实现了F(ab')2的高纯度分离,终制备的F(ab')2收率约70％,纯度为93％以上,具有良好的中和活性,其半数抑制浓度(IC50)为5.13 μg/ml.结论 制备了高纯度马抗MERS-CoV免疫球蛋白F(ab')2,为人用抗MERS-CoV免疫球蛋白F(ab')2生产工艺的建立奠定了基础.
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基因治疗用pUC118-ski质粒DNA纯化工艺的建立及其质量控制
目的 建立基因治疗用pUC 118-ski质粒DNA的纯化工艺,并进行质量鉴定.方法 采用碱裂解法粗提质粒,PEG/MgCl2沉淀法初步纯化后,依次通过Sepharose 6 FF分子筛层析、PlasmidSelect Xtra亲和层析和SOURCE30Q离子交换层析纯化质粒DNA.纯化的质粒DNA经琼脂糖凝胶电泳分析超螺旋质粒的比例;紫外分光光度计测定质粒的A260和A280值,以A260/A280比值评价其纯度;CCK-8法检测质粒促原代培养的大鼠皮肤成纤维细胞的增殖活性;BCA法和鲎试剂凝胶法分别检测质粒DNA中残留的蛋白质和内毒素含量;PCR法检测质粒中细菌基因组DNA的含量.结果 经Sepharose 6 FF分子筛层析可有效去除质粒DNA中的RNA,经PlasmidSelect Xtra亲和层析能将超螺旋质粒DNA(scDNA)与开环质粒DNA(ocDNA)有效分离,经SOURCE30Q离子交换层析获得的质粒DNA纯度很高,但出现了少量ocDNA.获得的质粒DNA纯品中超螺旋质粒所占比例大于90.5％;纯度(A260/A280)为1.83;促原代培养的大鼠成纤维细胞的增殖活性与空载体组相比提高了22.9％ (P＜0.05),与纯化前的质粒促细胞增殖活性一致;内毒素含量小于50 Eu/mg;几乎检测不到蛋白质残留;细菌基因组DNA残留量小于1.2μg/mg.结论 建立了基因治疗用pUC 118-ski质粒DNA的纯化工艺,纯化产品的质量指标均符合国家食品药品监督管理局(SFDA)的标准,为申请该基因药物的临床试验及大规模制备质粒DNA奠定了基础.
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轮状病毒规模化纯化方法的建立
目的 建立一种可规模化纯化轮状病毒( Rotavirus,RV)的方法.方法 以氯化铯密度梯度离心法(离心法)纯化RV作为对照,分析采用离心-微滤-超滤-层析法(模块法)纯化RV的可行性.透射电镜观察病毒形态；微量滴定法测定病毒的感染性滴度；Bradford法检测纯化前后病毒液的蛋白含量,计算蛋白同收率；以两种方法纯化的病毒免疫BALB/c小鼠,微量中和试验检测小鼠血清中和抗体滴度.结果 模块法纯化的RV结构完整,感染性滴度可达(7.15±0.10)IgCCID50,可清除超过95％的蛋白质,蛋白回收率为(2.58±0.06)％,免疫小鼠可诱导中和抗体.模块法纯化的RV蛋白回收率、感染性滴度及诱导的小鼠中和抗体水平均显著高于离心法(P＜0.05或P＜0.01).结论 模块法可有效纯化RV,为RV灭活疫苗规模化纯化工艺的开发提供了实验依据.
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伤寒Vi多糖柱层析纯化工艺的优化
目的 优化伤寒Vi多糖柱层析纯化工艺,以替代传统苯酚抽提、乙醇分级沉淀法.方法 采用DEAE离子交换层析柱,分别在缓冲液(20 mmol/L Tris-C1)pH值为6.0、7.0和8.0的条件下纯化1批伤寒Vi多糖粗糖,并与传统苯酚抽提、乙醇分级沉淀法进行比较.按《中国药典》三部(2010版)要求检测纯化样品的蛋白质含量、核酸含量、O-乙酰基含量、分子大小及内毒素含量,并计算样品的多糖回收率.采用优化的DEAE柱层析纯化工艺纯化3批伤寒Vi多糖粗糖,验证该工艺的稳定性.结果 DEAE离子交换柱缓冲液(20 mmol/L Tris-Cl)pH值为7.0和8.0时,可有效将伤寒Vi多糖的杂质与纯化产物分离,多糖回收率分别为36.52％和38.35％,明显高于传统工艺的多糖回收率(15.52％),且纯化产物的内毒素含量(10 EU/μg)明显低于传统工艺(200 EU/μg).以优化工艺(pH 7.0)纯化3批伤寒Vi多糖粗糖获得的6批精糖的蛋白质含量、核酸含量、O-乙酰基含量、分子大小、内毒素含量及多糖回收率差异较小,标准偏差均小于5％.结论 优化了伤寒Vi多糖柱层析的纯化工艺,该工艺稳定性良好,可替代传统苯酚抽提、乙醇分级沉淀法,应用于伤寒Vi多糖的纯化.
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两种不同工艺制备的人凝血因子Ⅷ的比较
目的 比较甘氨酸/NaC1沉淀工艺(盐析工艺)和层析工艺制备的人凝血因子Ⅷ(FⅧ).方法 对盐析工艺和层析工艺制备的工艺过程样品和成品,采用双缩脲法检测蛋白含量,ACL7000血凝仪检测FⅧ凝固活性,并计算比活性,按《中国药典》三部(2010版)要求进行Tween-80残留量、TNBP残留量、外观、可见异物、水分、热原和异常毒性检测.结果 层析工艺中以新鲜冰冻血浆为原料制备冷沉淀能较好地保证FⅧ的收率;聚乙二醇沉淀步骤能降低操作体积;层析处理能有效去除杂蛋白,使FⅧ比活至少提高25倍;S/D和80 ℃ 72 h病毒灭活处理对FⅧ质量无明显影响.两种工艺制备成品的外观、可见异物、异常毒性和热原检查均符合《中国药典》三部(2010版)相关规定,但层析工艺中FⅧ比活明显高于盐析工艺,并且对TNBP和Tween-80的去除效果更显著.结论 层析工艺制备的FⅧ比活、Tween-80和TNBP残留量等关键性指标均优于甘氨酸/NaCl沉淀工艺,该工艺更适于FⅧ的规模化生产.
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新型层析技术在人乳头瘤病毒L1蛋白病毒样颗粒快速纯化中的应用
目的 采用新型层析技术快速纯化人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)L1蛋白病毒样颗粒(virus-likeparticles,VLPs).方法 应用新型的基于阴离子交换和分子筛原理的色谱填料CaptoCore 700初纯昆虫细胞表达的HPV L1蛋白VLPs,再用高流速、高分辨力的阴离子交换树脂Capto Q ImpRes进一步纯化.各步纯化的样品经SDS-PAGE进行分析,采用ImageQuant图像分析软件分析两步纯化后蛋白的纯度,并对初纯蛋白进行质谱分析;改良Lowry法测定初纯蛋白的浓度,并计算杂蛋白去除率.结果 昆虫细胞表达的HPV L1蛋白经CaptoCore 700初纯后,目标蛋白组成的VLPs存在于流穿组分中,经质谱分析,为目的蛋白HPV L1;料液处理量为1个柱体积时,杂蛋白去除率达80％,料液处理量为2个柱体积时,杂蛋白去除率为76％.初纯的蛋白经Capto Q ImpRes进一步层析纯化,HPV L1蛋白的纯度接近100％.结论 CaptoCore 700加Capto Q ImpRes两步层析纯化能够快速高效地纯化HPV L1蛋白VLPs,整个工艺过程简单、快速、高效、易放大,适用于大规模生产.
