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支气管哮喘患者外周血T淋巴细胞凋亡及相关基因的表达
我们对哮喘患者的外周血T淋巴细胞的活化诱导细胞凋亡(AICD)及影响细胞凋亡的分子调控机制进行了检测和分析，以期为揭示哮喘的慢性气道炎症机制提供依据。 对象与方法按1997年《支气管哮喘防治指南》［1］，选择初治哮喘患者10例为哮喘组，男、女各5例，平均 (35.8±10.3)岁。选择10名无吸烟史的健康人为对照组，男、女各5例，平均(35.9±11.0)岁。于淋巴细胞分离液中分离外周血单个核细胞（PBMC），尼龙毛柱分离出T淋巴细胞。一部分加入PHA-P液（终浓度为10 μg/ml）和IL-2（终浓度为50U/ml），另一部分仅加入IL-2（终浓度为50 U/ml），然后同时体外培养24 h。回收培养T细胞用AnnexinV法和碘化丙啶(PI)染色法检测T细胞凋亡。AnnexinV凋亡检测试剂盒购自美国Pharmingen公司，按说明书进行免疫荧光标记和流式细胞分析。PI染色法：将细胞加入75%乙醇，-20℃冻存12 h以上。检测前取出细胞加入PI、RNAase，避光孵育15 min后行流式细胞分析。用荧光素(FITC)-Fas单抗及藻红素（PE）-CD3单抗标记，流式细胞检测T细胞膜表面Fas受体的表达情况。用TRIZOL反应剂提取培养T细胞的总RNA，用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增Bax、Bcl-XL特异性基因片段。特异性引物序列（Bax：5′GGACCCGGTGCCTCAGGA，3′CAAAGATGGTCACGGTCTGC；Bcl-XL：5′TTGGACAATGGAC TGGTTGA，3′GTAGAGTGGATGGTCAGTG）及反应条件参照文献［2］。通过凝胶图像扫描及分析系统，以扩增的特异性DNA片段的荧光强度与同时扩增的内参照GAPDH片段的荧光强度比值作为特异性扩增片段的半定量检测值。统计学分析采用F检验、t检验、直线相关分析。
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去分化来源表皮干细胞与在体表皮干细胞之间的差异分析
目的:比较去分化来源的表皮干细胞与在体表皮干细胞之间的异同点.方法:采用碱性成纤维细胞诱导因子(bFGF)诱导表皮细胞去分化形成表皮干细胞;由人包皮分离、培养在体表皮干细胞.采用免疫细胞化学染色法、流式细胞检测技术、细胞染色体核型检测技术及逆转录-聚合酶链式反应法(RT-PCR)观察去分化来源的表皮干细胞与在体表皮干细胞之间细胞表面标志蛋白表达、细胞亚群及染色体核型等方面的差异.结果:免疫细胞化学染色结果表明,去分化来源的表皮干细胞能够表达表皮干细胞及其亚群特异性的表面标志蛋白,如β1整合素、角蛋白19(CK19)、CK14等,而CK10的表达为阴性.流式细胞技术检测结果显示去分化来源的表皮干细胞及在体表皮干细胞中α6+CD71-、α6+CD71+及CD71表达阳性的细胞亚群分别占被检测细胞总数的22.8%、68.14%、0及45.39%、33.11%、0.02%.细胞染色体核型检测分析结果显示去分化来源的表皮干细胞与在体表皮干细胞的染色体均为23对、46条,核型正常.此外,RT-PCR检测结果表明去分化来源的表皮干细胞与在体表皮干细胞中β1整合素、CK19、CK14及CK10的mRNA表达水平差异无显著性.结论:去分化来源的表皮干细胞和在体表皮干细胞之间存在着细胞亚群的分布差异,提示其具有更强的增殖能力;二者在细胞核型和表面标志蛋白表达等方面具有相似性.去分化来源的表皮干细胞可以作为表皮干细胞的替代细胞应用于皮肤重建与再生的相关研究.
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不同实验技术在多发性骨髓瘤中的应用
目的 研究形态学、免疫组化和流式细胞检测在多发性骨髓瘤中的应用效果.方法 选取我院2016年1月—2017年1月收治的60例多发性骨髓瘤患者为研究对象,选择免疫组化与流式细胞术观察其细胞免疫表型,分析骨髓瘤细胞形态与相关检测指标之间的内在关系.结果 免疫组化与流式细胞之间差异无统计学意义,P>0.05,形态学与两者之间差异存在统计学意义,P<0.05.结论 流式细胞术与免疫组化检测效果相较于形态学灵敏度更高,将三种技术有机结合,能够进一步提升临床诊断效果.
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三羟异黄酮对环磷酰胺致神经细胞早期凋亡的干预作用研究
目的观察三羟异黄酮对神经细胞早期凋亡的影响并对其可能机制进行探讨.方法在培养48h的神经细胞中加入高中低3个剂量的三羟异黄酮,30 min后加入环磷酰胺8 mg/L诱导其发生凋亡,在凋亡的早期阶段以流式细胞仪和扫描电镜进行检测观察,并与环磷酰胺单独给药组作比较.结果①流式细胞仪检测结果提示三羟异黄酮在一定浓度下可使神经细胞凋亡发生率发生显著的下降,呈现明显的抑制作用;②扫描电镜观察发现三羟异黄酮可抑制早期凋亡的神经细胞膜改变的程度,与流式细胞仪检测结果一致.结论一定剂量的三羟异黄酮可抑制环磷酰胺致神经细胞凋亡,对神经细胞具有较好的保护性作用.
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脑脊液流式细胞检测在中枢神经系统白血病诊断中的价值
近年来，随着分子生物学及细胞遗传学技术的进展，化疗方案和支持治疗的不断改进，急性白血病的缓解率及5年生存率明显的提高，但仍有部分患者因复发导致治疗失败，中枢神经系统白血病（central nervous system leukemia ，CNSL ）是髓外复发的主要部位，也是治疗失败的重要原因之一，主要原因是化疗药物的脂溶性及血脑屏障使中枢神经系统成为白血病细胞的“庇护所”，成为日后复发的原因之一。因此早期、有效诊断CNSL对减少白血病复发具有重要意义。目前CNSL 的诊断主要是在脑脊液沉渣涂片中发现白血病细胞，但是由于脑脊液标本量较少，细胞数量低，且仅从形态上区分是淋巴细胞还是白血病细胞多靠经验，导致一些CNSL的误诊及漏诊。本实验通过流式细胞免疫分型技术检测25例急性白血病完全缓解患者脑脊液，与传统的脑脊液生化、常规、沉渣细胞学检测相比较，探讨流式细胞免疫分型在CNSL诊断中的应用价值。
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紫外线照射充氧自血回输对银屑病患者淋巴细胞凋亡及T细胞亚群的影响
资料和方法 银屑病患者组40例，男28例，女12例；年龄16～64岁，平均39.4岁；病程2周～32年，平均7.8年；健康对照组20名，均为健康查体者，其性别、年龄与银屑病组无统计学差异。 采用北京产WL-2型光量子血液治疗仪，紫外线波长253.7 nm，照射剂量24.5 mJ／cm2，具体操作步骤同参考文献［1］。隔日1次，10次为1个疗程。治疗前及疗程结束后取外周血备检。 凋亡基因-1(Fas)、白血病基因-2(Bcl-2)的蛋白表达及T细胞CD4抗原(CD4)的单克隆抗体均采用异硫氰酸荧光素标记(FasFITC、Bcl-2FITC、CD4FITC)，凋亡基因-2.7(Apo-2.7)蛋白表达物及T细胞CD8抗原(CD8)的单抗采用藻红蛋白标记(Apo-2.7PE、CD8PE)，T细胞CD3抗原(CD3)单抗为藻红蛋白双重标记(CD3PE-cy5)，上述试剂以及参照用IgG1FITC、IgGlPE、IgG1PE-cy5均由法国国际免疫公司生产，淋巴细胞分离液由中国医学科学院血液研究所生产。样品处理、免疫反应及流式细胞检测的详细方法同参考文献［2］。 统计方法：方差齐性检验后采用t或t′检验。
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慢性淋巴细胞白血病分层治疗
慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia,CLL)是小细胞惰性淋巴瘤的一种,异质性大,随着新药不断出现及对疾病生物学特性的深入了解,危险分层已经进入到临床常规,如何进行正确的危险分层并且有针对性地选择个体化治疗策略,是CLL临床治疗中的关键问题.
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条斑紫菜多糖PY-D2对小鼠脾淋巴细胞生长的影响
目的:研究条斑紫菜多糖体外提高机体免疫力的作用.方法:应用生化技术分离和纯化条斑紫菜多糖,获得条斑紫菜多糖2个组分,分别为PY-D1和PY-D2.体外培养条件下分别用不同浓度的PY-D2以及PY-D2与ConA或LPS协同处理小鼠脾淋巴细胞,通过MTT法观察条斑紫菜多糖对小鼠脾淋巴细胞生长的影响.采用流式细胞仪检测小鼠脾淋巴细胞的细胞周期变化.结果:PY-D2处理小鼠脾淋巴细胞72小时后对其生长有明显促进作用,且呈剂量依赖效应,0.25,0.5和1mg/ml条斑紫菜多糖处理小鼠脾淋巴细胞后,小鼠脾淋巴细胞的存活率分别为157.5%,162.1%和173.4%(P＜0.01).PY-D2与ConA或LPS共同处理小鼠脾淋巴细胞时,小鼠脾淋巴细胞的存活率高于ConA和LPS单独的作用,表现出明显的协同效应.流式细胞仪检测表明PY-D2可以促进小鼠脾淋巴细胞从G1期进入S期.结论:PY-D2可以促进小鼠脾淋巴细胞生长,为今后研究多糖提高机体免疫力的作用机理奠定了坚实的基础.
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红花对肾小管间质纤维化大鼠TGF-β1、TGF-β1 mRNA及c-fos表达的影响
我们前期实验研究表明,单味红花能够保护肾功能,减轻肾小管-间质纤维化病变[1],为了进一步探讨其作用机制,本研究观察了红花对转化生长因子-β1(transforminggrowth factor-β1,TGF-β1)、TGF-β1mRNA及原癌基因c-fos表达的影响.
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阿托伐他汀对高脂血症患者血小板CD62p的影响
阿托伐他汀作为他汀类药物,降脂作用效果肯定,本研究通过流式细胞检测高脂血症患者血小板表面激活标记物CD62p,旨在观察阿托伐他汀对其血小板活化功能的影响.
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下调miR-214对鼻咽癌CNE2细胞凋亡的影响
目的:研究miR-214对鼻咽癌细胞CNE2凋亡的影响及机制.方法:RT-PCR检测鼻咽癌细胞CNE2和正常鼻咽上皮细胞NP69细胞中miR-214的表达;通过miR-214 inhibitor转染鼻咽癌细胞CNE2,流式细胞仪(FCM)检测鼻咽癌细胞凋亡变化;并用Western印迹法检测细胞中Bcl-2和Bax蛋白的表达变化.结果:正常鼻咽上皮细胞明低表达miR-214,而鼻咽癌CNE2细胞中明显高表达miR-214(P＜0.05),miR-214 inhibitor可浓度依赖性的抑制miR-214的表达(P＜0.05).40μmol/L和5μmol/L的miR-214 inhibitor组细胞凋亡率分别为:(45.3±9.1)％和(12.3±3.8)％,而NC inhibitor组细胞的凋亡率为(5.1±0.4)％.miR-214 inhibitor可下调Bcl-2的表达(P＜0.05),对Bax的表达无明显影响.结论:miR-214可能通过下调Bcl-2的表达从而诱导CNE2细胞凋亡,这可能为鼻咽癌的治疗提供新靶点.
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流式细胞技术分析多壁碳纳米管对人多药耐药性胶质瘤细胞活力的影响
目的:建立荧光探针染色-流式细胞检测术(FCM)的方法用于分析多壁碳纳米管(MWCNTs)对人多药耐药性( MDR)胶质瘤细胞活力的影响。方法:将人MDR胶质瘤细胞给予不同浓度的MWCNTs处理24 h。随后以一系列反映细胞功能不同方面的荧光探针(JC-1、R123、FDA和PI)在原位（in situ）和非原位(ex situ)两种条件下对细胞进行染色，以FCM对各个探针的细胞染色情况进行检测。结果:在经过MWCNTs处理的细胞中，R123染色在in situ条件下呈浓度依赖性增强，但在ex situ条件下无明显改变。JC-1染色在in situ条件下呈显著浓度依赖性降低，但在ex situ条件下仅略微减弱。FDA染色在in situ条件下随MWCNTs浓度增加呈“钟形”改变，而在ex situ条件呈小幅度增强。P1染色阳性的细胞数在两种条件下均略微增加。结论:荧光探针染色结合FCM在经过验证优化以后可有效地用于研究MWCNTs的细胞效应。在本实验的MWCNTs处理浓度和时间条件下，人MDR胶质瘤细胞的总体活力未受明显影响。但涉及细胞膜的一些功能可能发生改变。
关键词： 多壁碳纳米管：胶质瘤细胞 流式细胞检测 细胞活力 -
人脂肪源性干细胞体外培养和鉴定研究
目的：建立人脂肪源性干细胞分离、体外培养及鉴定方法，以期为组织研究和临床应用提供细胞来源。方法通过脂肪抽吸术获取人腹壁下脂肪组织，经过PBS液反复冲洗，I型胶原酶消化，采用直接贴壁筛选培养法进行体外培养，从脂肪组织中分离、培养、扩增细胞。相差显微镜观察细胞一般形态学特征，应用MTT法绘制细胞生长曲线，采用流式细胞仪检测细胞表面抗原，检测 CD34、CD45、CD44、CD90表达。结果流式细胞仪检测表面标志物CD34、CD45表达阴性，CD44、CD90表达阳性。结论采用直接贴壁培养法进行体外培养可获得生长稳定、增殖能力强的脂肪干细胞。
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叶黄素对叔丁基过氧化氢诱导的视网膜神经节细胞凋亡的影响
目的：观察叶黄素对视网膜神经节细胞系（ RGC－5）的保护作用，并对其机制进行初步探讨。方法：将RGC－5细胞随机分为：对照组、t－BHP组、t－BHP和叶黄素共同作用组、叶黄素组，培养24 h，MTT检测细胞活力；Annexin V－FITC／PI 双染流式细胞仪检测细胞凋亡率；免疫细胞化学法检测caspase－3蛋白的活化情况；Western blot检测Bcl－2／Bax、cleaved caspase－3、JNK和c－Jun蛋白的变化。结果：MTT法和流式细胞检测结果显示叶黄素可对抗t－BHP诱导的RGC－5细胞凋亡；免疫荧光结果显示叶黄素可减少t－BHP诱导的caspase－3的活化；Western blot结果显示t－BHP处理后RGC－5细胞抗凋亡蛋白Bcl－2表达下调，促凋亡蛋白Bax和cleaved caspase－3表达上调，JNK和c－Jun蛋白的磷酸化水平增加，叶黄素能部分逆转上述结果。结论：叶黄素能够对抗t－BHP诱导的RGC－5细胞凋亡而显示其保护作用，其机制是抑制Bax／Bcl－2表达及caspase－3蛋白活化，并降低JNK和c－Jun蛋白的磷酸化。
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甲强龙冲击对重症肌无力患者外周血Treg及CD95的影响
目的 检测甲强龙冲击对重症肌无力患者外周血CD4+ CD25+调节性T细胞(Treg)及细胞凋亡因子CD95表达的影响及与不同临床疗效之间的关系. 方法 选择威海市立医院神经内科自2013年1月至2015年9月收治的重症肌无力患者(31例)及同期健康查体者(27例),采用流式细胞仪测定重症肌无力患者甲强龙冲击治疗前后和健康对照者外周血Treg与CD95表达的情况. 结果 经甲强龙冲击治疗后临床绝对评分≤3分并且相对评分≥0.5分患者外周血Treg百分率(13.39％±2.71％)高于健康对照者(8.35％±1.87％),差异有统计学意义(P＜0.05).经甲强龙冲击治疗后绝对评分＞3分以及相对评分＜0.5分患者外周血Treg百分率(8.17％±1.31％)稍低于健康对照者(8.35％±1.87％),差异无统计学意义(P＞0.05).经甲强龙冲击治疗后临床绝对评分≤3分并且相对评分≥0.5分患者外周血CD95百分率(36.47％±5.32％)与健康对照(35.28％±5.58％)差异无统计学意义(P＞0.05).经甲强龙冲击治疗后绝对评分＞3分以及相对评分＜0.5分患者外周血CD95百分率(34.97％±5.12％)与健康对照(35.28％±5.58％)差异无统计学意义(P＞0.05). 结论 甲强龙冲击后临床疗效明显好转的患者外周血Treg比率升高,CD95变化不明显.
关键词： 重症肌无力 CD4+CD25+调节性T细胞 CD95 流式细胞检测 甲强龙 -
93例B细胞非霍奇金淋巴瘤患者骨髓受累的诊断分析
目的：探讨骨髓细胞形态学与流式细胞在检测B细胞非霍奇金淋巴瘤（B‐NHL）骨髓受累中的价值。方法 B‐NHL患者同时做骨髓涂片和流式细胞检测。骨髓涂片经瑞士吉姆萨染色，分类计数骨髓细胞；流式细胞检测先处理样本后加荧光染色，上机处理。结果93例B‐N H L患者经骨髓涂片检测阳性者为11例，阳性率为11．8％；经流式细胞检测阳性者为27例，阳性率为29．0％，两种方法比较差异有统计学意义（ P＜0．05）。在11例骨髓涂片阳性的样本中，有1例经流式细胞检测为阴性。结论骨髓涂片和流式细胞检测都是诊断B‐NHL骨髓受累的重要方法，两者各有优势，联合运用两种方法可为诊断B‐NHL骨髓受累提供更准确的依据。
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CD4+NKT细胞在慢性乙型肝炎病毒感染中的意义
我们采用流式细胞术（flow cyto-metry）对慢性HBV感染者外周血CD4+NK-T、CD8+NK-T细胞的分布情况进行分析，并对细胞样品进行51Cr细胞毒性试验，以鉴定其细胞毒性。一、资料与方法1. 对象：病例为第一军医大学南方医院感染内科1999年5月至9月门诊及住院病人。选择慢性HBV携带者（AsC）18例、经肝组织活检证实的慢性乙型病毒性肝炎（中度）（CHB）18例，正常对照组12例取自门诊健康体检者。48例受检者中女14例，男34例，年龄17～42岁（平均32.4岁）；36例慢性HBV感染者均为HBsAg阳性（ELISA），27例HBeAg阳性，9例抗-HBe阳性；正常对照组除5例抗-HBs阳性外，其余对照者HBV血清标志物全部阴性。2. 方法：流式细胞检测（FACS）分析CD4+ NK-T、CD8+NK-T细胞的分布情况新鲜抗凝全血4ml，常规分离PBMC，在RPMI 1640培养液中、37℃培养2h，移去贴壁的单核细胞。2×106/ml非贴壁细胞继续以20U/ml rhuIL-12及100U/ml rhuIL-2刺激培养14d，加入FITC标记鼠抗人CD4单克隆抗体（mAb）或CD8 mAb、PE标记CD56-mAb 45min，作FACS，获得CD4+ NK-T和CD8+ NK-T细胞的百分率。所有病例均同步设一鼠抗人IgG（PE、FITC）细胞样品作为对照。
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碱性成纤维细胞生长因子诱导表皮细胞去分化的初步研究
目的 初步探索表皮细胞体外去分化模型的建立方法.方法 HEKa细胞体外培养6-7代时开始出现老化迹象,细胞体积膨大,形态发生明显改变.加入浓度为100 ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)诱导液分别培养6、12、24、48、72 h后,MTT法检测bFGF对表皮细胞体外生长的促进作用.同时采用免疫细胞化学染色法、流式细胞检测技术、RT-PCR法检测bFGF诱导培养后,表皮细胞的表型及功能的改变.结果 MTT检测结果显示浓度为100 ng/ml,诱导时间为36～48 h为诱导表皮细胞去分化的佳实验条件.在bFGF的作用之下,老化的HEKa细胞周围开始出现新生的表皮干细胞样克隆.免疫细胞化学检测结果表明,实验组细胞中β1整合素、CK19、CK14的表达增强,而CK10作为终末分化细胞的标志,在bFGF诱导组中的表达明显降低.流式细胞检测分析显示bFGF作用后,实验组CK19表达阳性的细胞与对照组相比明显增多(分别为74.77%和15.74%);CK14表达阳性的细胞也由原来的67.26%增加至被检测细胞总数的87.14%.而bFGF诱导作用后,被检测细胞中表达CK10阳性的细胞数量较对照组明显下降(分别为4.56%和98.56%).此外,RT-PCR检测结果同样再次支持了表皮细胞去分化的理论.在bFGF诱导组中,β1整合素、CK19、CK14 mRNA转录水平明显上调,而CK10 mRNA表达则明显下降.结论 bFGF能够在体外诱导表皮细胞逆转分化形成幼稚型表皮前体干细胞,但其涉及具体机制需要进一步研究.
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不对称二甲基精氨酸对人单核细胞株的活性及细胞周期的影响
目的 探讨不对称二甲基精氨酸(ADMA)对单核细胞株(THP-1)的活性及细胞周期的影响.方法 体外培养THP-1并且给予不同剂量的ADMA(3.75 μmol/L、7.5 μmol/L、15μmol/L、30 μmol/L)相互作用(24 h、48 h、72 h)后,用改良MTT法测定THP-1的活性状态及作用(24 h、48 h)后流式细胞仪测定细胞生长周期.实验分为空白组、阴性对照组、不同剂量ADMA组.结果 在MTT测定中与阴性对照组比较发现THP-1与ADMA共同培养下能够促进细胞的生长活性,流式细胞仪在细胞周期中检测显示ADMA能提高其细胞的S期和G2/M期峰值百分比,提示细胞处于增殖状态.结论 ADMA能够促进THP-1的生长活性及增殖状态.
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红毛五加多糖AHP-Ⅱ的荧光标记及其在小鼠腹腔巨噬细胞上的定位
目的:对红毛五加多糖AHP-Ⅱ的还原性末端进行选择性荧光标记,并观察AHP-Ⅱ与小鼠腹腔巨噬细胞结合情况.方法:利用胺化还原法对AHP-Ⅱ进行异硫氰酸荧光素(FITC)荧光标记,并通过紫外吸收光谱扫描和荧光分光光度术对偶联标记结果进行确证.通过测定多糖标记前后对小鼠腹腔巨噬细胞激活情况,检验该标记方法对AHP-Ⅱ生物学活性的影响.采用荧光显微技术和流式细胞术观察AHP-Ⅱ与小鼠腹腔巨噬细胞的结合情况.结果:AHP-Ⅱ荧光标记后的多糖得率和荧光标记效率分别为20.57％和0.809％.生物活性检测发现,AHP-Ⅱ还原性末端荧光标记后,对其激活小鼠腹腔巨噬细胞的能力没有显著影响(P＞0.05).荧光显微观察显示AHP-Ⅱ-FITC定位在小鼠腹腔巨噬细胞表面,流式细胞术检测发现在试验剂量范围内(50～200 μg·mL-1),巨噬细胞的荧光强度与AHP-Ⅱ-FITC加入量呈正相关,且荧光标记多糖与未标记多糖间存在竞争关系.结论:该方法可用于AHP-Ⅱ的标记研究,AHP-Ⅱ可与小鼠腹腔巨噬细胞细胞膜结合.
