沙尘与非沙尘PM2.5对人肺成纤维细胞缝隙连接通讯的影响

目的沙尘天气时大气中包括PM2.5在内的大气颗粒物浓度显著升高,对居民的生活和健康构成严重威胁.有关沙尘颗粒物健康效应的研究还比较少.本研究比较了沙尘与非沙尘PM2.5对人肺成纤维细胞缝隙连接通讯的影响.

β-胡萝卜素和维生素C对Ni2O3诱导人肺成纤维细胞转化的保护作用

为了探讨三氧化二镍(Ni2O3)诱导人肺成纤维(HLF)细胞恶性转化作用以及β-胡萝卜素和维生素C的保护作用,用不同浓度的Ni2O3在体外多次处理HLF细胞,利用刀豆凝集素A(ConA)凝集实验和软琼脂集落形成实验进行转化细胞的恶性鉴定;同时添加β-胡萝卜素(5.4mg/L)和维生素C的食物(1.8mg/L),观察对Ni2O3转化作用的影响.结果表明Ni2O3(0.5～2.0mg/L)可诱导HLF恶性转化,转化细胞生长速度加快,排列紊乱,失去接触抑制,呈交叉重叠生长,转化率呈剂量-效应关系.转化细胞可被低浓度ConA凝集,并在软琼脂内生长.添加β-胡萝卜素和维生素C的处理组比单用Ni2O3组的转化率显著下降(P<0.05),处理后细胞ConA凝集反应阴性,不能在软琼脂内生长.结论认为Ni2O3有较强的诱导HLF细胞恶性转化的能力,具有致癌性.β-胡萝卜素和维生素C对于镍诱导HLF恶性转化具有保护作用,提示职业接触镍的人群有必要在膳食中增加富含β-胡萝卜素和维生素C,以提高机体的抗氧化能力,从而提高机体的抗肿瘤能力.

大气PM10对两种不同细胞分泌炎性细胞因子的影响

目的 探讨大气可吸入颗粒物(PM10)对小鼠肺泡巨噬细胞(RAW264.7)和人肺成纤维细胞(HLF)分泌肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)和白细胞介素8(IL-8)的影响.方法 颗粒物样品采自北京市城区采暖期.两种染毒途径:(1)不同剂量的PM10直接对HLF染毒;(2)PM10首先作用于RAW264.7细胞,染毒一定时间后的细胞上清液再作用于HLF细胞.采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色(MTT)法测定细胞毒性;放射免疫法测定炎性因子TNF-α、IL-6和IL-8.结果 PM10作用24h后,表现为低剂量时刺激细胞增殖,而高剂量时抑制细胞增殖,细胞存活率随浓度增加而降低(P＜0.01);PM10能刺激HLF分泌炎性因子TNF-α、IL-6和IL-8,且有剂量-反应关系(P＜0.05);巨噬细胞上清液亦能刺激HLF产生TNF-α、IL-6和IL-8,且其产生量高于PM10作用于HLF产生的量(P＜0.05).结论 大气可吸入颗粒物PM10对HLF有一定毒性作用;PM10染毒24小时后能诱导人肺成纤维细胞分泌炎性因子TNF-α、IL-6和IL-8;巨噬细胞上清液亦能刺激人肺成纤维细胞释放上述三种炎性因子,其产生量高于PM10.

小柴胡汤的酚类代谢物体外诱导人肺成纤维细胞和外周淋巴细胞凋亡

小柴胡汤衍生物诱导人肺成纤维细胞与淋巴细胞凋亡

HMGB1对人肺成纤维细胞ERK1/2-NF-κB信号通路的影响及补阳还五汤含药血清的干预作用

目的:观察肺纤维化中诱导免疫损伤的高迁移率族蛋白Box-1(high mobility group Box-1 protein,HMGB1)刺激人肺成纤维细胞(HFL1)后细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinase1/2,ERK1/2),核转录因子-κB(nuclearfactor kappa B,NF-κB)信号通路的活化情况,以及补阳还五汤含药血清对HMGB1刺激HFL1后以上信号通路的干预作用.方法:采用含药血清药理学的实验方法,以5％,10％,15％,20％的补阳还五汤含药血清和空白血清来干预HMGB1诱导刺激的HFL1细胞.采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测白细胞介素-1β(IL-1β)的含量;采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测细胞总蛋白中ERK1/2,胞浆胞核中NF-κB p65蛋白的表达.结果:与空白组比较,HMGB1刺激组诱导后ERK 1/2蛋白,胞浆和胞核中NF-κB p65蛋白及IL-1β含量的表达均增高(P ＜0.05,P＜0.01);与20％空白血清预培养加HMGB1组比较,HMGB1刺激组诱导后ERK1/2蛋白,胞浆和胞核中NF-κB p65蛋白及IL-1β含量的表达均增高(P＜0.05);与HMGB1刺激组比较,补阳还五汤含药血清各组能够降低ERK1/2蛋白,胞浆和胞核中NF-κB p65蛋白及IL-1β含量的表达,其中15％和20％补阳还五汤含药血清组降低ERK1/2的表达(P＜0.05);胞浆10％补阳还五汤含药血清组和胞核20％补阳还五汤含药血清组降低NF-κB p65蛋白的表达(P＜0.05);15％补阳还五汤含药血清组降低IL-1β的含量(P＜0.05).结论:补阳还五汤含药血清在体外实验中,可抑制HMGB1引起的人肺成纤维细胞中ERK1/2/NF-κB信号通路的活化,减少IL-1β等炎症因子分泌.提示补阳还五汤可能通过调控人肺成纤维细胞中ERK1/2/NF-κB信号通路,防治肺纤维化的发生发展.

基于微流控芯片技术的三维细胞培养模式的建立及研究

目的 建立适于进行三维联合细胞培养的微流控芯片平台.方法 设计与制作一个多通道连接的高通量微流控芯片平台,通过向微通道内灌注含有细胞悬液胶质的方法构建三维立体培养体系,并通过注射泵连续供给细胞营养物质以模拟体内细胞生存的微环境,将肺癌细胞与人肺成纤维细胞置于体系中进行近似于人体生理条件下的气维联合细胞培养.结果 成功建立了适于进行三维联合细胞培养的微流控芯片平台,实现了肺癌细胞与人肺成纤维细胞的联合下维培养.三维培养状态下的细胞生长状态良好,人肺癌细胞围绕肺成纤维细胞成串状生长,与二维单层培养模式的伸展状态明显不同.结论 以基于微流控芯片技术的三维细胞培养模式为模型进行肿瘤生物学方面的研究,能够比较真实的反映肿瘤细胞的生物学特征,为微流控芯片技术在医学和生物学研究方面提供了一个新思路.

ADAM33对人肺成纤维细胞增殖、周期、凋亡的影响及IL-4对其表达影响的研究

目的 探讨解整合素-金属蛋白酶33(ADAM33)对人肺成纤维细胞MRC-5增殖、周期、凋亡的影响,以及白介素4(IL-4)对其表达的影响.方法 分别以1 ng/ml、10 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml浓度的IL-4刺激MRC-5,以未刺激组细胞为对照,实时荧光定量PCR法检测ADAM33 mRNA的表达情况,Western blotting法检测蛋白表达情况;设计并合成ADAM33-siRNA,瞬时转染MRC-5,MTS法检测增殖情况,流式细胞术检测细胞周期和凋亡.结果 当不同浓度的IL-4刺激MRC-5时,ADAM33 mRNA和蛋白的表达均呈浓度依赖性,1 ng/ml组与0 ng/ml组相比较,差异无统计学意义(P ＞0.05);10 ng/ml、50ng/ml、100 ng/ml与0 ng/ml组相比较,差异有统计学意义(P＜0.05);ADAM33-siRNA明显抑制了ADAM33在MRC-5中的表达;MTS结果显示,在24、48、72 h,干扰组的增殖明显低于阴性对照组,抑制率分别为27.3％、36.6％、19.2％;干扰组S期占的比例(31.69±4.14)％明显低于阴性对照组(47.19±0.99)％(P＜0.05);干扰组的细胞凋亡率(28.49±8.79)％明显高于阴性对照组(8.43±5.11)％(P＜0.05).结论 ADAM33可促进入肺成纤维细胞增殖,而细胞因子IL-4可促进其表达,它们可能在气道重塑中起着重要的作用.

中国人γ-IFN对放射性肺纤维化的防治作用

目的研究中国人γ-干扰素对放射诱导的人肺成纤维细胞(HLF)异常增殖的抑制作用,探讨其对放射性肺纤维化的防治作用及机理.方法MTT法检测细胞增殖,免疫细胞化学(SP)法观察成纤维细胞α-SMA的表达及ColⅣ的合成.结果①60Co γ射线能够诱导HLF的异常增殖,γ-IFN呈浓度依赖性抑制照射所致的HLF的异常增殖;②照射后HLF胞浆内有明显的α-SMA的表达,表明照射可以诱导FB向MFB转化;③照射后ColⅣ的表达增高,照射前给予γ-IFN,ColⅣ的表达相对单纯照射组明显降低.结论60Co γ射线通过直接促进HLF增殖、诱导FB向MFB转化和促进ColⅣ的分泌来诱导肺纤维化的发生;γ-干扰素通过抑制HLF的异常增殖和ColⅣ的分泌,对放射性肺纤维化具有防治作用.

IFN-γ拮抗60Co γ射线刺激肺成纤维细胞增殖的机制研究

目的 探讨IFN-γ拮抗60Co γ射线刺激人肺成纤维细胞(HLF)增殖的机制.方法 应用MTT比色法,观察TGF-β1、受照后大鼠血清促HLF增殖的时效和量效关系及IFN-γ对增殖的影响;用ELISA检测受照后大鼠血清、肺组织TGF-β1水平及IFN-γ对照后大鼠血清促HLF合成TGF-β1的影响.结果 TGF-β1有促HLF增殖的作用;受照后大鼠血清能促HLF增殖并合成TGF-β1;IFN-γ显著拮抗血清的上述作用;受照后1～4周大鼠血清和肺组织TGF-β1水平逐渐增加.结论 TGF-β1参与γ射线刺激HLF增殖的作用,而IFN-γ在一定程度上抑制HLF合成TGF-β1,并拮抗其促HLF增殖的作用.

白细胞介素-4,-13促进人肺成纤维细胞ADAM33基因的表达

研究发现ADAM33基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)与哮喘的发生以及气道高反应性有显著相关[1].ADAM33基因主要在肺的平滑肌细胞、成肌纤维细胞和成纤维细胞表达,而在上皮细胞、T细胞或免疫细胞中表达较少.由于ADAM33基因在肺间充质细胞的选择性表达,因此,ADAM33基因可能与小气道重塑有关.IL-4和IL-13都是Th2型细胞因子,在哮喘的慢性气道炎症中起重要作用.近研究发现IL-4和IL-13可以通过增加支气管上皮细胞对转化生长因子-β的释放,从而促进气道重塑[2].因此,我们研究IL-4和IL-13对人肺成纤维细胞ADAM33基因表达的影响,探讨ADAM33基因表达异常在哮喘气道重塑中的作用.

大气颗粒物PM10和PM2.5对人肺成纤维细胞及其炎性因子分泌的影响

目的 探讨大气颗粒物PM10和PM2.5对人肺成纤维细胞及其分泌肿瘤坏死因子(TNF-a)、白细胞介素6(IL-6)和白细胞介素8(IL-8)的影响.方法 于冬季采暖期采集颗粒物样品PM10和PM2.5,实验细胞为传代培养的人肺成纤维细胞,用剂量分别为25、50、100、200μg/ml的PM10和PM2.5对人肺成纤维细胞染毒24 h.采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法测定细胞毒性;放射免疫法测定炎性因子TNF-a、IL-6和IL-8.结果 25、50、100、200μg/ml的PM10作用于人肺成纤维细胞24 h后产生一定的毒性作用,低剂量时刺激细胞增殖,高剂量时抑制细胞增殖,各浓度时细胞存活率分别为118.80%,120.47%,107.42%,95.97%.25、50、100、200μg,/ml的PM2.5作用24 h后亦对人肺成纤维细胞产生一定的毒性作用,亦表现为低剂量时刺激细胞增殖,高剂量时抑制细胞增殖,各浓度时细胞存活率分别为107.81%,101.48%,91.86%,81.35%.PM10和PM2.5能刺激人肺成纤维细胞分泌炎性因子TNF-a、IL-6和IL-8,尤其200μg,/ml浓度时与对照组相比,各炎性分子浓度差异有统计学意义(P<0.05).结论 大气颗粒物PM10和PM2.5对人肺成纤维细胞有一定毒性作用;PM10和PM2.5染毒24 h后能诱导人肺成纤维细胞分泌炎性因子TNF-a、IL-6、IL-8.

沙尘暴颗粒物对人肺成纤维细胞的细胞毒性研究

目的探讨沙尘暴颗粒物(PM10、PM25)对人肺成纤维细胞的细胞毒性.方法分别用50、100、150、200μg/ml的PM10和PM25对人肺成纤维细胞进行染毒,24 h后测定细胞线粒体琥珀酸脱氢酶活力、细胞外乳酸脱氢酶和酸性磷酸酶的漏出量.结果50μg/ml以上浓度的沙尘暴颗粒物可剂量依赖性地抑制人肺成纤维细胞的线粒体琥珀酸脱氢酶活力.在更高染毒浓度,沙尘暴颗粒物可引起细胞外乳酸脱氢酶和酸性磷酸酶的漏出增加.结论沙尘暴颗粒物对人肺成纤维细胞可产生明显的毒性作用.线粒体可能是沙尘暴颗粒物毒作用的敏感部位.

血管紧张素Ⅱ对人肺成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白表达的影响

目的：探讨血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)对人肺成纤维细胞(human lung fibroblast,HLF)细胞株 HLF-1Ⅰ型胶原蛋白表达的影响。方法体外培养 HLF-1细胞。采用 Masson染色法检测 HLF-1细胞总胶原蛋白的表达,采用 Western blot 法检测 HLF-1细胞Ⅰ型胶原蛋白的表达。结果 AngⅡ呈时间依赖性地促进 HLF-1细胞总胶原蛋白及Ⅰ型胶原蛋白的表达,并且在 AngⅡ作用24 h 时达到峰值。结论 AngⅡ参与了 HLF-1胶原合成的调控,并可能在肺纤维化的发生、发展中起重要作用。

三氧化二镍诱导人肺成纤维细胞恶性转化的实验研究

在体外用不同浓度的Ni2O3多次处理人肺成纤维细胞(HLF),并进行转化细胞的恶性鉴定--刀豆凝集素A(ConA)试验和软琼脂细胞培养试验.发现Ni2O3可诱导HLF细胞恶性转化,转化细胞生长速度加快,排列紊乱,失去接触抑制,呈交叉重叠生长,在实验浓度范围内,转化率呈剂量-反应关系.转化细胞可被低浓度ConA凝集,并在软琼脂内生长.提示Ni2O3有较强的诱导人肺成纤维细胞恶性转化的能力,具有致癌性.

溶血磷脂酸对人肺成纤维细胞白细胞介素13受体α2mRNA表达的影响

背景:白细胞介素13受体α 2与白细胞介素13结合后,不介导白细胞介素13功能,对白细胞介素13起负调控作用.有研究表明,溶血磷脂酸能增加人支气管上皮细胞白细胞介素13受体α 2的表达,从而抑制白细胞介素13的作用.目的:验证溶血磷脂酸对人肺成纤维细胞白细胞介素13受体α 2 mRNA表达的诱导作用.设计、时间及地点:mRNA水平的观察对照实验,于2007-07/2008-11在南昌大学医学院和江西省医学生物高技术重点实验室完成.材料:人肺成纤维细胞HFL-1购于中科院上海生化和细胞生物研究所.方法:培养HFL-1细胞,行时间依赖和剂量依赖实验.时间依赖实验采用1 μ mol/L溶血磷脂酸刺激细胞,分别于0,6,12,24 h收集细胞.剂量依赖实验分别用0,0.1,1,10 μ mol/L的溶血磷脂酸刺激细胞,12 h收集细胞.主要观察指标:显微镜下观察溶血磷脂酸对HFL-1细胞生长的影响,提取HFL-1细胞总RNA,用反转录-聚合酶链反应及图像分析法剑测溶血磷脂酸对HFL-1细胞白细胞介素13受体α 2 mRNA表达的影响.结果:溶血磷脂酸不影响HFL-1细胞生长.1 μ mol/L溶血磷脂酸刺激HFL-1细胞,白细胞介素13受体α 2 mRNA的表达增高,并呈时间依赖性.随着溶血磷脂酸浓度的增加,白细胞介素13受体α 2 mRNA的表达明显增加.1 μ mol/L溶血磷脂酸刺激HFL-1细胞,白细胞介素13受体α 2 mRNA的表达可达高峰.溶血磷脂酸对HFL-1细胞白细胞介素13受体α 1 的表达无影响.结论:溶血磷脂酸能促进人肺成纤维细胞HFL-1白细胞介素13受体α 2 mRNA的表达.

CTGF反义寡核苷酸治疗肺纤维化的实验研究

目的:观察CGTF反义寡核苷酸对体外培养的人肺成纤维细胞的抗增殖作用.方法:将人肺成纤维细胞随机分为对照组、空载体转染组、CTGF反义寡核苷酸(CTGF-ASODN)组、CTGF正义寡核苷酸(CTGF-SODN)组.CTGF错义寡核苷酸(CT-GF-SCDN)组,转染后观察细胞的增殖程度以及CTGF mRNA的表达.结果:转染了CTGF反义寡核苷酸(CTGF-ASODN)组人成纤维细胞的增殖明显受到抑制,其CTGF mRNA的表达明显减少.结论:应用CGTF反义寡核苷酸可以起到对人肺成纤维细胞的抗增殖作用.

RNA干扰沉默Smad3对人肺成纤维细胞Ⅰ型胶原产生的影响

目的:转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)通过Smad3(drosophila mothers against decapentaplegic)依赖的细胞因子信号转导通路,促进I型胶原的合成和分泌,在哮喘气道重塑中起重要作用.近年来RAN干扰技术在基因治疗及功能研究取得很大进步,本实验探讨RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术沉默Smad基因表达对人肺成纤维细胞(human lung fibroblast-1,HLF-1)合成I型胶原的影响.方法:设计并合成Smad3特异性小发卡干扰RNA(short hairpin RNAs,shRNA),用脂质体转染入培养的人HLF-1细胞,反转录聚合酶链反应(reverse transfection PCR,RT-PCR)法和蛋白质印迹(Western blot)法观察基因沉默效果,酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunoadsordent assay,ELISA)检测RNA干扰对人HLF-1细胞合成I型胶原的影响.结果:shRNA-Smad3成功转染入人HLF-1细胞并有效沉默Smad3的表达,RT-PCR结果显示shRNA-Smad3转染后Smad3mRNA表达与正常对照组和阴性对照组比较,分别降低68.2％和69.5％,差异有统计学意义(P＜0.05)；Westem blot结果显示shRNA-Smad3转染后Smad3蛋白表达与正常对照组正常对照组和阴性对照组比较,分别降低了67.1％和64.7％,差异有统计学意义(P＜0.05).ELISA检测结果显示shRNA-Smad3转染后I型胶原为正常对照组和阴性对照组的59.3％和61.1％,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:shRNA-Smad3能有效沉默HLF-1细胞中Smad3 mRNA和Smad3蛋白的表达,并减少HLF-1细胞I型胶原的合成.为进一步应用干扰RNA技术治疗哮喘患者气道重塑提供新的思路.

百草枯致体外培养人胚肺成纤维细胞凋亡及氧化损伤

[目的]观察百草枯(PQ)对体外培养人胚肺成纤维细胞(MRC-5)的毒性作用,并探讨可能的损伤机制. [方法]不同浓度(0.00、0.15、0.30、0.60、1.20、2.40、4.80、9.60mmol/L)PQ处理MRC-5细胞24h后,采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)测定MRC-5细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡情况;同时用分光光度比色法测不同浓度(0.00、0.15、0.30、0.60、1.20mmol/L)PQ处理3、12、24h后,MRC-5细胞超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量和细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性. [结果]与对照组相比,PQ≥0.30mmol/L时开始明显抑制细胞生长,并随着染毒浓度的增加细胞存活率明显下降(P＜0.05).与对照组相比,短时间、低剂量(3、12h,0.15mmol/L)作用下,SOD活性下降不明显,其他组别明显下降(P＜0.05);与对照组相比,染毒后不同时点MDA含量均较自身对照上升,LDH含量较对照上升(除染毒3h,1.20mmol/L组),且差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01);0.60、1.20 mmol/L组PO染毒后MRC-5细胞凋亡率明显上升(P＜0.05). [结论] PQ对MRC-5细胞活性的影响存在剂量依赖性,并可影响MRC-5细胞的抗氧化酶活性和细胞凋亡.

S100A9对肺成纤维细胞的增殖及活性的影响

观察S100A9对人胚肺成纤维细胞(human embryo lung fibroblast,HLF)增殖、合成细胞因子和胶原的影响,并探讨S100A9活化细胞的可能机制.用CCK-8法检测不同浓度S100A9(0～1000 ng/ml)体外培养人肺成纤维细胞24 h、48 h或72h的细胞增殖反应.选择100 ng/ml S100A9刺激HLF细胞24 h后,采用Real-time PCR检测细胞表达IL-6、IL-8、IL-1β、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA水平;用ELISA测定细胞上清液中上述细胞因子的蛋白水平;Western blot法检测细胞表达晚期糖基化终产物受体(RAGE)蛋白的变化.与对照组相比,5～500 ng/ml浓度范围内的S100A9对细胞均有明显的促增殖作用.S100A9可显著提高HLF细胞表达IL-6、IL-8、IL-1β的mRNA水平,且细胞培养上清液中上述炎症因子蛋白水平亦升高;S100A9可促进细胞合成Ⅲ型胶原mRNA水平升高,但对促纤维化因子TGF-β、CTGF、IL-4 mRNA的表达无影响.此外,S100A9可诱导成纤维细胞表达RAGE基因和蛋白水平增多.以上结果说明,S100A9能促进人肺成纤维细胞增殖以及合成炎症因子、胶原增多,且S100A9可能通过与细胞表面受体RAGE结合而活化成纤维细胞,表明S100A9可能在肺间质纤维化的发病机制中起着相对重要的作用.