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天麻素通过蛋白激酶B/p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路抑制H9c2心肌细胞凋亡
目的 采用血清剥夺/复灌的大鼠H9c2心肌细胞模拟心肌缺血/再灌注损伤(I/R),从细胞层面探讨天麻素(gastrodin)抗H9c2心肌细胞凋亡的作用及其机制.方法 体外培养H9c2心肌细胞随机分为对照组、血清剥夺(0.5～6 h)处理组、血清剥夺/复灌(2/4 h)处理组、天麻素(10、20和40μmol/L)处理组、天麻素(20 μmoL/L)+渥曼青霉素(wortmannin)(1μmol/L)处理组、wortmannin(1μmol/L)处理组.采用免疫印迹法检测p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)、蛋白激酶B(Akt)、p-Akt以及凋亡相关蛋白cleavedCaspase-3、Bcl-2和Bax的表达变化;采用流式细胞术检测细胞凋亡;通过实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测Caspase-3、Bcl-2和Bax的mRNA表达变化;采用免疫荧光双标记法检测细胞内p-Akt蛋白水平表达的变化.结果 血清剥夺(0.5～6 h)和血清剥夺/复灌(2/4 h)处理诱导细胞凋亡水平增加;加入不同浓度天麻素处理,与血清剥夺(0.5～6 h)和血清剥夺/复灌(2/4 h)处理组比较,凋亡相关蛋白cleaved Caspase-3表达降低,Bcl-2/Bax蛋白表达的比值上调(P＜0.05),基因转录水平检测的Caspase-3和Bax表达量降低,Bcl-2表达量上调((P＜0.05),流式细胞术凋亡检测结果也同样显示,天麻素能抑制血清剥夺/复灌(2/4 h)诱导的细胞凋亡(P＜0.05);同时,血清剥夺(0.5～6 h)和血清剥夺/复灌(2/4 h)处理能抑制Akt/p38MAPK信号通路;加入不同浓度的天麻素(10、20和40μmol/L)处理后,p-Akt的表达水平增多,p-p38MAPK蛋白表达减少(P＜0.05).加入Akt的特异性抑制剂wortmannin(1μmol/L)处理后,天麻素对上述因子的调控作用被反转(P＜0.05).结论 在H9c2心肌细胞中,天麻素通过激活Akt/p38MAPK信号通路,抑制血清剥夺/复灌诱导的细胞凋亡,从而发挥抗心肌I/R损伤的保护作用.
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人参皂苷Rg1通过自噬抑制Raw 264.7巨噬细胞凋亡
目的 探讨人参皂苷Rg1在血清剥夺诱导的Raw 264.7巨噬细胞自噬和凋亡中的作用及其机制.方法 体外培养小鼠Raw 264.7巨噬细胞随机分为空白对照组、不同时间(12、24、36、48和60h)血清剥夺处理组、人参皂苷Rg1(50μmol/L)+不同时间(24、36和48h)血清剥夺处理组;依据佳血清剥夺时间进一步分为空白对照组、血清剥夺(36h)处理组、人参皂苷Rg1(50μmol/L)+血清剥夺(36h)处理组、人参皂苷Rg1(50μmol/L)+血清剥夺(36h) +3-甲基腺嘌呤(3-MA)(5mmol/L,1h)处理组.采用Western blotting检测LC3、Atg 5、Beclin 1、cleaved Caspase-3、Bel-2及Bax蛋白水平的表达变化;采用免疫荧光双标记检测细胞内LC3蛋白水平表达的变化;采用Hoechst 33342/PI荧光双染检测细胞凋亡的变化.结果 不同时间(12、24、36、48和60h)血清剥夺诱导Raw264.7巨噬细胞凋亡;与血清剥夺处理组相比,人参皂苷Rg1处理组LC3、Atg 5及Beclin 1蛋白表达水平显著上调;加入3-MA抑制剂后,凋亡细胞较人参皂苷Rg1处理组明显增多,且Bcl-2蛋白表达水平明显下调的同时,cleaved Caspase-3和Bax蛋白表达水平则显著上调.结论 人参皂苷Rg1通过促进血清剥夺诱导的Raw 264.7巨噬细胞自噬,发挥抗凋亡的保护作用.
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免疫荧光双标记法在子宫平滑肌肿瘤中的应用
随着激光共聚焦显微镜及其技术的推广，石蜡组织免疫荧光标记的方法也日益广泛运用，尤其是荧光双标或多标的方法，因其具有敏感性高、信号分明的特点，成为广大科研工作者喜欢使用的技术方法。荧光双标实验过程较为复杂，它的成功与否会受到很多因素的影响，如果某些环节处理不恰当，会直接导致实验失败[1]。本研究以子宫平滑肌肿瘤为研究对象，分为子宫平滑肌肉瘤组（LMS）、普通型子宫平滑肌瘤组（OUL）、正常子宫平滑肌组（NUSM）3组，选择Survivin和Ki-67两种与细胞增殖和凋亡相关的蛋白，采用免疫荧光双标记法检测各组中2种蛋白的表达情况，取得了较为满意的效果，现以异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）与四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethyl rhodamine isothio-cyanate，TRITC）的荧光双标为例，介绍免疫双荧光切片制备及运用激光共聚焦显微镜采集信号数据的方法。
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受体megalin和cubilin介导白蛋白吸收的免疫组织化学研究
目的及方法采用免疫荧光双标记技术对培养的opossum肾(OK)细胞膜受体megalin和cubilin的表达及其与荧光标记的白蛋白摄取的关系进行研究.结果不同荧光标记的受体megalin及cubilin同时表达在相同的OK细胞上,分布主要局限在细胞膜,而且形式相似.被摄取的荧光标记的白蛋白点状分布在OK细胞内.此外,有受体megalin和cubilin表达的细胞就有白蛋白的摄取;反之,既不表达受体megalin和cubilin的细胞,也没有白蛋白的摄取.结论这种白蛋白的摄取与受体megalin和cubilin表达的特征提示,两种大分子糖蛋白受体megalin和cubilin与白蛋白的摄取有密切相关性,很可能在肾小管重吸收白蛋白中起到相互作用.
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长期失喉返神经支配患者环杓后肌GDNF及其受体GDNFR-α1变化的研究
目的 探讨长期失喉返神经支配后,人环杓后肌胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derivedneurotrophic factor,GDNF)及其受体GDNFR-αl的变化规律.方法 38例不同时限喉返神经损伤的患者,按神经损伤时限归入0.5～年、1～年、2～年、≥3年组.对照组12例,为因喉癌行喉全切除术且肿瘤未侵及环杓后肌者.采用免疫荧光双标记法分别标记GDNF和GDNFRαl,运用图像分析系统对环杓后肌GDNF和GDNFRαl表达变化进行评估.结果 失神经0.5～年组、1～年组环杓后肌GDNF和GDNFR-αl表达的平均灰度值和阳性区百分比显著高于其他各组(P<0.001),失神经0.5～年组明显高于失神经1～年组(P<0.001).对照组、失神经2～年组、失神经≥3年组之间无显著性差异(P>0.05).结论 失神经支配1年内环杓后肌GDNF和GDNFR-αl表达较高,失神经支配1～2年内环杓后肌GDNF和GDNFR-αl仍有表达,说明失神经支配2年以内喉肌GDNF的功能状态较好.
