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细胞内吞受体megalin 和cubilin在胚胎期小鼠肾的表达
目的 研究细胞内吞受体megalin和cubilin在胚胎发生发育小鼠肾的表达,及其与肾小管发生发育的相关性. 方法 采用免疫组织化学方法 检测不同胚龄小鼠肾(每组5只)megalin和cubilin的表达.同时,结合透射电镜观察肾近端小管与细胞内吞功能相关的细胞器的发育变化. 结果 胚龄9.5d时,megalin和cubilin表达于中肾管及中肾小管上皮细胞游离面.胚龄11d至18d,两受体表达于输尿管芽上皮细胞游离面,在S小体期肾小管近腔面呈弱阳性表达,肾小管胞内吞体及溶酶体少见,微绒毛稀疏.随着近髓肾单位细胞内吞体及微绒毛发育成熟,两受体表达局限于近端小管近腔面及刷状缘. 结论 megalin和cubilin 在胚胎肾发生发育中,从表达在分化早期所有小管近腔面胞质,到局限于成熟期近端小管游离面刷状缘,提示两受体协同重吸收功能是随着近端小管上皮细胞的发育而逐渐形成的.
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福辛普利对糖尿病肾病大鼠肾小管间质的影响
目的 观察福辛普利对糖尿病肾病大鼠Cubilin、结缔组织生长因子(CTGF)和α平滑肌抗体(α-SMA)的影响.方法 将SD大鼠随机分为糖尿病肾病(DN)组(n=9)、福辛普利治疗(DN-F)组(n=8)和正常对照(NC)组(n=6);检测各组大鼠第6周Cubilin、CTGF和α-SMA的水平. 结果 与DN组相比,DN-F组的Cubilin显著升高,CTGF和α-SMA明显降低(P＜0.05).结论 福辛普利能显著提高DN大鼠Cubilin的表达,降低CTGF和α-SMA的表达,延缓肾脏纤维化.
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剪切应力增加致肾小管上皮细胞megalin/cubilin mRNA表达的变化及效应
目的 检测剪切应力作用下肾小管上皮细胞megalin/cubilin mRNA表达的变化,探讨糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)早期肾小管间质病变的发生机制.方法 应用流室系统(flow chamber)提供0.5、1 Pa(5、10dyn/cm2)的剪切应力处理培养的肾小管上皮细胞,分别作用1、3、6h后,用RT-PCR法检测megalin/cubilin mRNA的表达.结果 剪切应力以大小、时间依赖性的方式下调肾小管上皮细胞megalin/cubilin mRNA的表达.结论 DN早期流体剪切应力的增加可下调肾小管上皮细胞megalin/cubilin mRNA的表达,从而减少了肾小管对蛋白质的重吸收.表明DN早期微量白蛋白尿的发生可能与肾小管间质的早期损伤有关.
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受体Megalin和Cubilin在Opossum肾小管细胞的表达及定位
目的检测肾小管细胞膜大分子糖蛋白受体Megalin和Cubilin在Opossum肾小管(OK)细胞的表达及亚细胞分布.方法采用Western印迹法、免疫荧光双标记法及免疫细胞化学双标记法.结果受体Megalin及Cubilin在分离的OK细胞膜上有表达,荧光双标记显示两种受体十分相似地分布在细胞周边部,电镜下,标记金颗粒的两种受体相近地分布在细胞顶部胞质的细胞内吞系统.结论两种受体在OK细胞上的分布特征与两种受体在体内肾近端小管小皮细胞的分布相似,提示OK细胞可成为研究两种受体介导可能的、未知的配体细胞内吞功能的有效细胞株,二者可能在一些大分子的重吸收中起到相互作用.
关键词： megalin cubilin OK细胞 Western印记法 免疫细胞化学技术 -
受体megalin和cubilin介导白蛋白吸收的免疫组织化学研究
目的及方法采用免疫荧光双标记技术对培养的opossum肾(OK)细胞膜受体megalin和cubilin的表达及其与荧光标记的白蛋白摄取的关系进行研究.结果不同荧光标记的受体megalin及cubilin同时表达在相同的OK细胞上,分布主要局限在细胞膜,而且形式相似.被摄取的荧光标记的白蛋白点状分布在OK细胞内.此外,有受体megalin和cubilin表达的细胞就有白蛋白的摄取;反之,既不表达受体megalin和cubilin的细胞,也没有白蛋白的摄取.结论这种白蛋白的摄取与受体megalin和cubilin表达的特征提示,两种大分子糖蛋白受体megalin和cubilin与白蛋白的摄取有密切相关性,很可能在肾小管重吸收白蛋白中起到相互作用.
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受体Megalin和Cubilin在培养的Opossum肾近端小管细胞的表达
目的及方法采用Westem印迹法及免疫细胞化学双标记法检测肾近端小管培养的OK细胞株上受体megalin及cubilin的表达及分布.结果受体megalin及cubilin在分离的OK细胞膜上有所表达,并且,应用me-galin及cubilin抗体的免疫细胞化学双标记法显示,它们分布在细胞内顶部胞质的细胞内吞系统,包括微绒毛根部的有被小凹、胞内的有被吞饮小泡、大泡、溶酶体及参与细胞膜再循环的顶部致密小管.结论这一分布特征提示,两种大分子糖蛋白受体与肾近端小管上皮细胞受体介导的细胞内吞功能有关.由于其分布极其接近,很可能在一些大分子的重吸收中起到相互作用.
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肾小管重吸收白蛋白的受体蛋白与小管-间质损害
Cubilin是属于低密度脂蛋白(LDL)受体超家族的一种吞饮受体,广泛分布于体内多种组织上皮细胞,大量研究表明Cubilin参与多种生物代谢产物的跨细胞转运,也是肾小管上皮细胞负责转运白蛋白、脂蛋白等物质重要的吞饮受体蛋白.本文对近年来Cubilin参与肾小管跨细胞转运及与肾小管-间质的联系作一综述.
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肾小管重吸收白蛋白的分子机制及病理意义
正常人体由于肾小球的有限滤过以及肾小管重吸收功能,尿液中的白蛋白(albumin,Alb)含量极为有限.但当免疫或非免疫因素损害肾小球滤过屏障或者肾小管功能发生障碍时,尿中Alb排泄量会显著增加.研究发现,肾小管间质病变进展速度与尿蛋白含量有关,降低尿蛋白可延缓肾脏疾病进展[1].Alb作为肾小球滤液中重要的一种蛋白质,可以激活肾小管上皮细胞内核转录因子κB(NF-κB),诱导炎性浸润、细胞凋亡以及间质纤维化,进而导致肾小管萎缩和肾功能减退[2].本文旨在对近来有关肾小管重吸收Alb的研究作一综述.
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同型半胱氨酸代谢异常的分子遗传学机制研究进展
高同型半胱氨酸血症是心脑血管性疾病的危险因素.血浆同型半胱氨酸(Hcy)水平受遗传和环境等因素的影响,近几年来人们开始致力于从分子遗传学角度分析Hcy的代谢通路以筛选与血浆Hcy水平有确切关联的候选基因.文章对影响Hcy代谢通路的常见关键酶N5,N10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)、编码叶酸结合蛋白(Folbp1)的基因FOLR1和编码内因子即维生素B12受体(cubilin)的基因CUBN的分子遗传学及其与Hcy代谢关系的研究作了综述.
关键词： 同型半胱氨酸 亚甲基四氢叶酸还原酶 叶酸结合蛋白 cubilin -
高糖与切应力对肾小管上皮细胞megalin及cubilin表达的影响及其意义
目的 观察高糖与切应力对肾小管上皮细胞白蛋白受体megalin、cubilin表达的影响并探讨其意义.方法 链尿菌素(STZ)腹腔注射SD雄性大鼠制作糖尿病肾病(DN)模型,以健康SD雄性大鼠为对照.于第2、4、6周分别检测尿白蛋白量(24 h);免疫组化法检测各组肾脏megalin、cubilin蛋白的表达.将体外培养的肾近端小管上皮细胞(NRK-52E)分为空白对照组、甘露醇组、高糖组,并以平行板流室系统提供0.5、1.0 Pa的切应力处理各组NRK-52E细胞,分别作用1、3、6 h.以RT-PCR法检测各组细胞megalin、cubilin mRNA表达.结果 对照组肾脏megalin、cubilin蛋白表达水平高于相应时间点DN组(P＜0.05).肾脏megalin、cubilin表达水平与尿白蛋白量(24 h)呈负相关r=-0.832及-0.815,均P＜0.05).高糖抑制NRK-52E细胞megalin、cubilin mRNA的表达(P＜0.05).切应力加载抑制细胞megalin、cubilin mRNA的表达,其抑制作用比单纯高糖更明显,且与切应力大小及作用时间有关(P＜0.05).结论 DN早期高滤过导致滤出液对肾近端小管上皮细胞的切应力增加,其与高糖协同作用可下调细胞megalin、cubilin mRNA的表达,减少肾小管对白蛋白的重吸收,是DN早期微量白蛋白尿发生的机制之一.
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反义cubilin RNA对白蛋白刺激肾小管上皮细胞分泌趋化因子的影响
目的观察反义cubilin RNA对白蛋白刺激人近端肾小管上皮细胞(HK-2)表达单核细胞趋化蛋白(MCP)-1、RANTES的影响.方法应用基因克隆技术构建反义及正义cubilin真核表达载体(ocDNA-ACUB、pcDNA-CUB),酶切鉴定及序列测定证实插入序列是否正确.脂质体DOTAP将其转染至HK-2细胞,流式细胞仪(FCM)检测反义cubilin RNA对HK-2细胞重吸收白蛋白的抑制作用.细胞转染72h后给予高浓度白蛋白(10 g/L)刺激24 h,细胞ELISA、Western印迹法检测HK-2细胞表达MCP-l、RANTES的变化.结果pcDNA-ACUB转染组白蛋白摄取率较DOTAP组显著降低(P＜0.01).与DOTAP组比较,pcDNA-ACUB转染组HK-2细胞MCP-0、RANTES的表达显著降低(P＜0.001).结论反义cubilin RNA可抑制肾小管上皮细胞对白蛋白的摄取,并能拮抗白蛋白刺激肾小管上皮细胞趋化因子的表达,提示cubilin在白蛋白介导的肾小管上皮细胞分泌趋化因子中起重要作用.
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质粒表达型siRNA对人近端肾小管上皮细胞cubilin表达的抑制作用
目的 观察cubilin siRNA真核表达载体对人近端肾小管上皮细胞(human renal proximal tubular epithelial cell line,HKC)cubilin基因的特异性抑制作用.方法 针对人cubilin基因设计并构建siRNA真核表达载体pSUPER EGFP-C1和pSUPER EGFP-C2,转染HKC,经荧光定量PCR(FQ-PCR)检测cubilin mRNA的表达、不同浓度的人血清白蛋白(HSA)刺激正常HKC及转染重组质粒的HKC 24 h后cubilin mRNA的表达,并通过激光共聚焦扫描荧光显微镜观察HKC对白蛋白摄取情况的变化.结果 FQ-PCR显示HSA刺激正常HKC后cubilin mRNA表达具有剂量依赖性.与正常对照组相比,两个重组质粒均可部分抑制HKC cubilin表达,抑制效率分别为66%和37%,HSA刺激转染pSUPER EGFP-C1、pSU-PER EGFP-C2的HKC后cubiin mRNA水平较正常对照组比较分别下降50%、34%,转染了重组质粒的HKC对白蛋白的摄取明显减少.结论 成功地构建了针对人cubilin基因的RNA干扰真核表达载体,表达型siRNA可抑制肾小管上皮细胞cubilin基因的表达及对白蛋白的摄取.
关键词： cubilin RNA干扰 siRNA 人近端肾小管上皮细胞 -
Cubilin反义RNA对大鼠肾小管超负荷重吸收白蛋白的抑制作用
目的 探讨经肾动脉灌注腺病毒载体介导Cubilin反义RNA对肾小管超负荷重吸收白蛋白的抑制作用.方法 建立大鼠阿霉素肾病模型,正义RNA组和反义RNA组分别经肾动脉缓慢灌注GFP基因标记的pAdEasy-Cub和pAdEasy-ACub,对照组和模型组灌注等量生理盐水.激光共聚焦显微镜下观察GFP的表达,并监测24 h尿蛋白量及其他生化指标;光镜下观察肾小管间质病理变化;免疫组化法观察肾小管Cubilin基因的表达以及肾小管上皮细胞内白蛋白的沉积.结果 转染第4天,正、反义RNA组肾脏GFP基因有较强表达,11 d达到高峰,可持续至实验结束;反义RNA组与其他各组相比,24 h尿蛋白量明显增高(P＜0.01),小管间质病变轻微,Cubilin阳性表达率低,且与白蛋白的沉积呈显著正相关(r=0.896,P＜0.01).结论 经肾动脉途径灌注重组腺病毒,能器官靶向性表达外源基因;Cubilin反义RNA对肾小管超负荷重吸收白蛋白有明显的抑制作用,并可以有效地减轻蛋白尿引起的肾间质损伤.
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腺病毒介导Cubilin反义RNA对肾小管上皮细胞Cubilin蛋白诱导表达的抑制作用
目的构建细菌内同源重组型的Cubilin反义RNA腺病毒表达载体并研究其对肾小管上皮细胞Cubilin蛋白诱导表达的影响.方法 PCR 扩增大鼠Cubilin起始编码区767 bp 的DNA 片段,与T载体连接,测序鉴定连接方向,通过选择反向和同向的双酶切位点与腺病毒穿梭载体pAdtack-CMV 同时酶切和连接,构建反向插入(正向插入作为对照)的腺病毒穿梭载体.将PmeⅠ线性化的腺病毒穿梭载体pAdtack-ACUB和pAdtack-CUB转染包含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1 的受体菌BJ5183(AdEasyTMXL) 进行同源重组.用含有卡那霉素的LB 平板筛选同源重组阳性的克隆, PacⅠ酶切和测序鉴定后,转染包装细胞(293细胞),经病毒扩增和纯化后,再以OD 法和GFP 法计算重组腺病毒的滴度.经免疫印迹法分析Cubilin反义RNA 对Cubilin 蛋白质诱导表达的抑制作用.结果成功构建了Cubilin的反义RNA腺病毒表达载体(pAdEasy-ACUB)和对照正义RNA腺病毒表达载体(pAdEasy-CUB),滴度为2.0 ×1010pfu/ ml、1.8×1010pfu/ ml;Cubilin反义RNA腺病毒表达载体转染可明显抑制大鼠肾小管上皮细胞的Cubilin 蛋白的诱导表达.结论 Cubilin的反义RNA腺病毒表达载体的成功构建以及对肾小管上皮细胞Cubilin蛋白诱导表达的明显抑制作用,为在基因水平的研究和治疗蛋白尿引起的肾间质损伤奠定了良好的基础.
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人cubilin蛋白功能片段原核表达系统的建立
目的构建编码白蛋白吞饮受体人cubilin(hcubilin)蛋白配体结合域CUB7-8基因片段的原核表达载体,诱导表达并鉴定表达产物.方法重组DNA技术构建原核表达载体pGEX-hCUB7-8,IPTG诱导表达,SDS-PAGE与免疫印迹法鉴定表达产物,Pull down实验验证融合蛋白是否与白蛋白结合.结果双酶切和测序鉴定表明CUB7-8片段插入正确,诱导表达后获得分子量为52×103的融合蛋白,该融合蛋白可以被抗GST抗体识别,并且可以和白蛋白结合.结论CUB7-8基因片段编码的蛋白质能在原核细胞中正确表达,并且可以和白蛋白结合,这为进一步研究该功能域的结构与功能奠定了基础.
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Cubilin在糖尿病肾病大鼠模型的表达变化
目的 观察链脲佐菌素(STZ)糖尿病肾病大鼠模型肾小管Cubilin的表达变化,及其与白蛋白尿的关系,探讨糖尿病肾病早期的肾小管功能障碍可能的机制.方法 糖尿病肾病大鼠(DN)模型采用STZ一次性腹腔注射制备,正常组(N)大鼠注射等量生理盐水.于实验2、4、6周分别处死两组大鼠并测量相关血尿生化指标,应用免疫组化和RT-PCR技术观察各组大鼠的肾小管Cubilin蛋白和mRNA表达水平.结果 与正常组相比,DN组大鼠肾小管的Cubilin蛋白和mRNA表达水平在第2周即明显下降(P＜0.05),并随时间推移继续降低,各时间点差异有统计学意义(P＜0.05),Cubilin mRNA的表达水平与白蛋白尿呈显著负相关(r=-0.815,P＜0.01).结论 肾小管Cubilin表达的下降可能部分参与了糖尿病肾病早期微量白蛋白尿的发生,Cubilin可望作为糖尿病肾病肾小管受损的早期标志之一.
