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去甲斑蝥素对白蛋白刺激肾小管上皮细胞增殖及上调纤维连接蛋白表达的影响
目的 观察去甲斑蝥素(NCTD)对白蛋白刺激人近端肾小管上皮细胞株(HK-2)增殖及上调FN表达的影响,初步探讨NCTD延缓肾问质纤维化的体外作用机制.方法 通过细胞毒性实验筛选出对HK-2细胞无明显损伤的NCTD适合浓度.将HK-2细胞随机分为5组:对照组(1640培基组),白蛋白组(1640+白蛋白5g/L),各浓度NCTD组(1640+白蛋白5g/L+NCTD 0.5,1,2.5mg/L).在各组HK-2细胞中加入相应干预液孵育24h后,采用细胞增殖法(MTT法)检测NCTD对白蛋白刺激HK-2细胞增殖的影响;酶联免疫吸附试验(ELISA)测定各组细胞上清中FN的蛋白含量:RT-PER法半定量分析HK-2细胞中FN mRNA的表达.结果 ①比较对照组及NCTD(0.5,1.0,2.5 mg/L)各组的乳酸脱氢酶(LDH)浓度,各组间的差异无统计学意义(P>0.05);②白蛋白组MTT值(0.438±0.073)明显高于对照组(0.330±0.060)(P<0.05),而NCTD(2.5 mg/L)组MTT值(0.327±0.080)较白蛋白组降低(p<0.05);③与白蛋白组比较,NCTD(2.5mg/L)组HK-2细胞上清中FN蛋白含量降低,差异有统计学意义(P<0.01):NCTD(1mg/L和2.5mg/L)组细胞上清中FN mRNA的表达较白蛋白组明显下调,差异有统计学意义(P<0.01).结论 白蛋白(5g/L)诱导HK-2细胞增殖及FN过表达,一定浓度去甲斑蝥素可抑制白蛋白对HK-2细胞的活化作用.
关键词： 斑蝥素 人近端肾小管上皮细胞 MTT法 纤维连接蛋白 -
乙型肝炎病毒感染肾小管上皮细胞Toll样受体4的表达及其作用
目的 探讨HBV感染人近端肾小管上皮细胞系HK-2后对其表达Toll样受体4(TLR4)的影响,并观察TLR4抗HBV感染的生物学作用.方法 收集HBV DNA拷贝在107-102/ml的患者血清,通过显微镜及免疫荧光法观察HBV阳性血清感染HK-2前、后细胞形态及α抗平滑肌抗体(α-SMA)的变化,应用MTT法检测不同浓度TLR4刺激因子(LPS)及TLR4抑制因子(CLI-095)对HK-2细胞增殖的影响.选取10 μL/ml脂多糖(LPS)及5μg/ml CLI-095作用于HBV感染的HK-2细胞,通过细胞免疫荧光技术及免疫印迹法检测HK-2细胞内TLR4蛋白的变化,ELISA法和荧光定量PCR法观测各组细胞上清液中HBsAg、HBeAg和HBV DNA含量的变化.结果 HBV分别感染HK-2细胞12 h和24 h后,随感染时间延长,细胞形态变得不规则,数量也减少.α-SMA的表达水平与感染24 h后相比,在HBV感染12 h后表达多.LPS浓度在小于10μg/ml范围内,HBV感染HK-2细胞24 h后其增殖程度与剂量呈正相关,与CLI-095浓度呈负相关(P＜0.05).LPS组HK-2细胞TLR4蛋白的表达高于CLI-095组,其上清液中HBV DNA水平及HBsAg、HBeAg表达水平较CLI-095组降低.结论 TLR4可能通过免疫炎症反应参与抑制HK-2细胞中的HBV复制,当HBV感染肾组织细胞时可发挥抗病毒作用.
关键词： 肝炎病毒 乙型 脂多糖类 Toll样受体4 人近端肾小管上皮细胞 -
人近端肾小管上皮细胞诱导表达吲哚胺2,3-加双氧酶的实验研究
目的 了解培养的人近端肾小管上皮HK2细胞株吲哚胺2,3-加双氧酶(IDO)的诱导表达情况及其影响因素.方法 实验分为不同浓度(0、500、1 000、2 000U/ml)γ-干扰素(IFN-γ)刺激培养组和IFN-γ2 000U/ml刺激12、24、48、72h不同时点培养组,以10%胎牛血清DMEM培养基作为正常对照组.RT-PCR检测不同培养条件下HK2细胞IDO mRNA的表达,免疫细胞化学染色检测24h后HK2细胞IDO的表达,高效液相色谱法检测培养基中犬尿氨酸、色氨酸浓度.结果 正常HK2细胞不表达IDO mRNA和IDO蛋白.不同浓度IFN-γ刺激后,HK2细胞IDO mRNA 的表达呈剂量依赖性升高,与正常对照组相比差异显著(P＜0.05),同时IDO mRNA表达还呈时间依赖性地增高,以48h为佳刺激时间.免疫组化染色显示,经IFN-γ刺激24h后,HK2细胞IDO蛋白表达增强,高效液相色谱检测显示刺激组培养基上清中犬尿氨酸特异性代谢率升高,表明表达的IDO具有生物活性,并且其活性呈IFN-γ剂量依赖性地升高.结论 IFN-γ刺激培养的HK2细胞IDO表达升高并具有活性,推测病理状态下人肾小管上皮细胞诱导表达的IDO有可能参与了肾小管-间质的病理损害过程.
关键词： 吲哚胺2 3-加双氧酶 干扰素Ⅱ型 人近端肾小管上皮细胞 -
结缔组织生长因子反义寡核苷酸抑制血管紧张素Ⅱ诱导人近曲肾小管上皮细胞肥大
目的:进一步探讨结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)反义寡核苷酸对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的肾小管细胞肥大的影响. 方法:采用体外培养的人肾近端小管上皮细胞株(HK2),分别采用考马斯亮蓝法、流式细胞分析技术及扫描电镜和透射电镜,观察CTGF反义寡核苷酸对AngⅡ诱导的细胞内总蛋白含量、细胞周期分布改变及细胞直径和超微结构改变的影响. 结果:AngⅡ干预HK2细胞48h后,细胞内总蛋白含量显著增加 (P＜0.01);这种作用可被CTGF反义寡核苷酸显著抑制,且呈时间和浓度依赖性.AngⅡ干预HK2细胞后,细胞大部分阻滞在G0-G1期(P＜0.01),而CTGF反义寡核苷酸可逆转这种周期阻滞现象(P＜0.05).经AngⅡ干预的HK2细胞,细胞平均直径显著增加,细胞超微结构显示表面微绒毛减少、细胞内粗面内质网增多、线粒体减少、高尔基体增加,这些作用均可被CTGF反义寡核苷酸所抑制. 结论:CTGF反义寡核苷酸对AngⅡ诱导HK2细胞肥大具有显著的抑制作用,提示CTGF可能介导了AngⅡ诱导的肾小管上皮细胞肥大.
关键词： 人近端肾小管上皮细胞 血管紧张素Ⅱ 结缔组织生长因子 细胞肥大 -
血管紧张素Ⅱ对培养的人近端肾小管上皮细胞结缔组织生长因子mRNA表达的影响
目的:研究血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)对人近端肾小管上皮细胞结缔组织生长因子mRNA表达的影响.方法:采用体外培养人近端肾小管上皮细胞株(HPTC),分别观察不同浓度(0、10-9、10-7、10-5mol*L-1)Ang Ⅱ处理48 h,或用Ang Ⅱ(浓度为10-7mol*L-1)处理不同时间(0、12、24、48、72 h)对HPTC结缔组织生长因子(CTGF)mRNA表达的影响,CTGF mRNA表达采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定.结果:Ang Ⅱ(10-7mol*L-1)作用于HPTC 12 h后,细胞CTGF mRNA的表达开始增加,72 h达高水平,与对照组相比,Ang Ⅱ作用48 h后显著增加[(0.097±0.015)vs(0.632±0.041),P<0.01];无Ang Ⅱ的DMEM培养HPTC,72 h内细胞CTGF mRNA水平未见明显改变(P>0.05).不同浓度(10-9、10-7、10-5mol*L-1)Ang Ⅱ作用于HPTC 48 h,CTGF mRNA的表达均有增加,分别是对照组(0 mol*L-1)的1.5、5.5和7.4倍(P<0.01),对扩增产物进行测序证实与基因库中人CTGF的cDNA序列一致.结论:Ang Ⅱ呈时间和剂量依赖性地刺激HPTC CTGF mRNA表达,此结果提示Ang Ⅱ可能通过促进CTGF表达而参与小管间质纤维化的发生.
关键词： 血管紧张素Ⅱ 人近端肾小管上皮细胞 结缔组织生长因子 信使核糖核酸 -
血管紧张素Ⅱ及其受体拮抗剂对人肾小管细胞MCP-1 mRNA 表达的影响
近年来研究表明,肾脏局部肾素血管紧张素系统(RAS)的激活在慢性肾病进展中起着十分重要的作用,肾小管上皮细胞在促进小管间质炎症反应和纤维化形成中起十分关键的作用[1,2].单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)是趋化因子家族的重要一员,在肾脏的炎症反应中对炎症细胞的趋化和激活有重要影响.文献中曾报道血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)可以诱导系膜细胞MCP-1 mRNA表达[3],但AngⅡ对小管上皮细胞MCP-1表达影响如何,文献报道尚少.因此,本实验通过体外培养的人近端肾小管细胞(HPTC),探讨AngⅡ对HPTC MCP-1 mRNA表达的影响,以进一步阐明AngⅡ、MCP-1在介导肾间质纤维化中的作用机制,为临床合理应用RAS阻断剂治疗慢性肾病提供理论依据.
关键词： 血管紧张素Ⅱ 单核细胞趋化蛋白-1 人近端肾小管上皮细胞 -
二十碳五烯酸对白蛋白诱导肾小管上皮细胞转分化的影响
目的 探讨二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)对人白蛋白诱导的人近端肾小管上皮细胞(HK-2)发生转分化的干预作用.方法 体外培养人HK-2细胞,随机分为6组:A组,空白对照组(未加任何刺激物);B组,单纯EPA组(加入30 μmol/L EPA);C组,血白蛋白(albumin,Alb)诱导组(加入5 mg/ml Alb);D组,低剂量EPA干预组(5mg/ml Alb+ 10 μmol/L EPA);E组,中剂量EPA干预组(5mg/ml Alb+ 30 μmol/L EPA);F组,高剂量EPA干预组(5 mg/ml Alb+ 50μmol/L EPA).细胞免疫荧光检测E钙黏蛋白(E-cadherin)、α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle ac-tin,α-SMA)的表达;ELISA法检测纤维连接蛋白(fibronectin,FN)的水平;采用RT-PCR检测转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)的mRNA表达.结果 与A组比较,B组TGF-β1mRNA、α-SMA、FN、E-cadherin表达均无统计学差异(P＞0.05);C组TGF-β1 mRNA、α-SMA、FN较其他各组表达明显增高(P＜0.05),而E-cadherin表达明显下降(P＜0.05).与C组比较,D组、E组、F组TGF-β1 mRNA、α-SMA、FN表达逐渐下降,两组间比较差异有统计学意义(P＜0.05);E-cadherin的表达逐渐增高,各组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).提示EPA可显著抑制Alb刺激人肾小管上皮细胞表达E-cadherin、α-SMA,同时下调上清液中FN水平,且其抑制作用的强弱与EPA浓度密切相关.EPA还明显下调了Alb刺激后TGF-β1的表达.结论 一定浓度的人白蛋白可以诱导体外培养的HK-2细胞发生转分化;EPA可一定程度上抑制白蛋白诱导HK-2发生转分化过程,且呈剂量依赖性.
关键词： 二十碳四烯酸 白蛋白 人近端肾小管上皮细胞 转分化 -
丹参多酚酸盐对人肾小管上皮细胞血管性血友病因子裂解酶表达的影响
目的 观察丹参多酚酸盐对人肾小管上皮细胞血管性血友病因子裂解酶表达的影响,初步分析其意义.方法 肾小管上皮细胞体外培养,将细胞接种在培养瓶中,待细胞融合至80%～90%时,更换含有丹参多酚酸盐终浓度分别为0、0.1、0.5、1.0、2.0 mg/L的培养基,培养24 h后,收集人肾小管上皮细胞并提取mRNA,转化为cDNA,用实时定量荧光聚合酶链反应技术(RT-PCR)检测人肾小管上皮细胞血管性血友病因子裂解酶mRNA的表达,并经凝胶成像行半定量分析.结果 以空白对照人肾小管上皮细胞表达的血管性血友病因子裂解酶mRNA量为参照1,则0.1、0.5、1.0、2.0 mg/L浓度丹参多酚酸盐共培养后的人肾小管上皮细胞表达的血管性血友病因子裂解酶mRNA依次为2.39、3.05、4.65和6.65,数据为重复2次实验的平均值.结论 人肾小管上皮细胞可表达血管性血友病因子裂解酶mRNA,丹参多酚酸盐能增加人肾小管上皮细胞血管性血友病因子裂解酶的表达.丹参多酚酸盐对肾小管上皮细胞血管性血友病因子裂解酶的调节可能会影响肾脏局部循环的出血、凝血状态,可能是丹参多酚酸盐的药理机制之一.
关键词： 血管性血友病因子裂解酶 丹参多酚酸盐 人近端肾小管上皮细胞 -
阿魏酸钠对高糖诱导肾小管上皮细胞损伤的保护作用
目的 观察阿魏酸钠(sodium ferulate,SF)对高糖培养的人近端肾小管上皮细胞(human proximal tubular epithelial cells,HKC)增殖和凋亡的影响.方法 选用对数期生长的肾小管上皮细胞,分为对照组、高糖组、高糖加阿魏酸钠组.四甲基偶氮唑盐(microculture tetrazolium,MTT)法观察细胞增殖能力的变化,测定细胞培养液中的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)的含量以判断细胞损伤情况,Hoechst 33258荧光染色检测细胞凋亡.结果 与对照组比较,高糖组MTT吸光度值(OD值)随培养时间延长明显降低,而高糖加阿魏酸钠组OD值与高糖组比较有明显升高(P＜0.05).随培养时间的延长,高糖组培养基中LDH水平明显升高,在12h和24h分别为(17.55±2.45)和(28.72±3.1l)U/L,而高糖加阿魏酸钠组12h和24 h LDH水平降至(11.84±2.18)和(19.98±3.67)U/L,和同时间点高糖组比较均有明显降低(P＜0.05).高糖处理组培养液中的丙二醛(malondiadehycle,MDA)水平较对照组明显增加(P＜0.01),超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)活性明显降低(P＜0.01),阿魏酸钠组培养液中MDA水平明显降低(P＜0.01),SOD活性明显增加(P＜0.05,P＜0.01).Hoechst 33258荧光染色显示,对照组和高糖加阿魏酸钠组仅见个别凋亡形态细胞,高糖组典型凋亡形态细胞明显增多,细胞凋亡率为34.17％,显著高于正常对照组(5.20％)和高糖加阿魏酸钠组(7.39％,P＜0.01).结论 高糖培养可诱导人近端肾小管上皮细胞的损伤和凋亡,并抑制其增殖.阿魏酸钠对人肾小管上皮细胞系(human kidney cell,HKC)的保护作用可能是通过抑制HKC的损伤和凋亡,以及提高增殖能力实现的.
关键词： 阿魏酸钠 高糖 人近端肾小管上皮细胞 -
脂多糖促进人近端肾小管上皮细胞TLR4的表达
目的:研究人近端肾小管上皮细胞(HKC)在脂多糖(LPS)刺激下Toll样受体4(TLR4)的表达及作用.方法:实验细胞分两组,LPS刺激组(50 mg/LLPS加入体外培养的HKC)和正常对照组;应用免疫荧光染色在激光共聚焦显微镜下观察LPS刺激24 h后TLR4在HKC中的分布及表达强弱;半定量RT-PCR和免疫蛋白印迹检测各组TLR4及内参照β-actin在mRNA水平和蛋白水平的表达量;Annexin V-FITC结合流式细胞仪检测各组细胞的早期凋亡率情况.结果:LPS刺激组TLR4的免疫荧光强度显著高于正常对照组,TLR4主要分布于HKC的胞膜及胞质区;刺激组TLR4 mRNA表达高于正常对照组(1.051+-0.082比0.38+-0.036),差异有显著性(P<0.01);刺激组TLR4蛋白表达高于正常对照组(O.371+-0.033比0.105+-0.008),差异有显著性(P<0.01);LPS刺激组细胞的早期凋亡率(41.29%)显著高于正常对照组(2.36%).结论:LPS能刺激HKC高表达TLR4,且促进HKC的早期凋亡,TLR4可能在LPS诱导的HKC凋亡中发挥一定的作用.
关键词： 脂多糖 人近端肾小管上皮细胞 Toll样受体4 细胞凋亡 -
特异性shRNA抑制人近端肾小管上皮细胞Toll样受体4的表达
目的:研究RNA干扰法对人近端肾小管上皮细胞(HKC)中Toll样受体4(TLR4)表达的抑制作用.方法:将针对TLR4分子设计的采用体外转录生物合成的特异性短发卡RNA(shRNA)双链分子用脂质体转染的方法导入体外培养的HKC;应用免疫荧光染色在共聚焦显微镜下观察TLR4的分布及表达强弱;半定量RT-PCR和免疫蛋白印迹检测TLR4及内参照β-actin在mRNA水平和蛋白水平的表达量.结果:干扰组TLR4的荧光强度显著低于对照组,其mRNA和蛋白的表达量分别下降了67%和62%.同时观察到TLR4主要分布于HKC细胞的胞膜及胞质区.结论:采用生物体外转录的方法成功合成针对TLR4的shRNA双链分子,并有效地转入HKC细胞中使TLR4的表达下调.
关键词： 短发卡RNA RNA干扰 人近端肾小管上皮细胞 Toll样受体4 -
Rho激酶信号转导通路对醛固酮诱导的人肾小管上皮细胞间质转分化的影响?
目的：探讨Rho激酶对醛固酮( ALD)诱导的人肾小管上皮细胞间质转分化的影响。方法人肾小管上皮细胞( HK-2)培养于含15%FBS的 RPMI-1640培养液中,依普利酮(10μmol/L )和 Rho激酶抑制剂Y27632(1μmol/L)预处理细胞30 min后,100 nmol/L ALD作用HK-2细胞24或48 h, ELISA法测定培养上清液中Rho激酶蛋白的含量,实时定量PCR检测细胞α-SMA、E-cadherin mRNA的表达,Western blot测定细胞α-SMA、E-cadherin蛋白的表达。结果 ALD显著上调HK-2细胞Rho激酶蛋白的表达及α-SMA mRNA和蛋白的表达,减低E-cadherin mRNA和蛋白的表达。 Rho激酶抑制剂Y27632及依普利酮可拮抗上述效应。结论ALD可激活HK-2细胞Rho激酶的活化,并通过Rho激酶诱导HK-2细胞间质转分化而加速肾小管间质纤维化的进展。
关键词： 醛固酮 上皮细胞间质转分化 Rho激酶 人近端肾小管上皮细胞 小管间质纤维化 -
质粒表达型siRNA对人近端肾小管上皮细胞cubilin表达的抑制作用
目的 观察cubilin siRNA真核表达载体对人近端肾小管上皮细胞(human renal proximal tubular epithelial cell line,HKC)cubilin基因的特异性抑制作用.方法 针对人cubilin基因设计并构建siRNA真核表达载体pSUPER EGFP-C1和pSUPER EGFP-C2,转染HKC,经荧光定量PCR(FQ-PCR)检测cubilin mRNA的表达、不同浓度的人血清白蛋白(HSA)刺激正常HKC及转染重组质粒的HKC 24 h后cubilin mRNA的表达,并通过激光共聚焦扫描荧光显微镜观察HKC对白蛋白摄取情况的变化.结果 FQ-PCR显示HSA刺激正常HKC后cubilin mRNA表达具有剂量依赖性.与正常对照组相比,两个重组质粒均可部分抑制HKC cubilin表达,抑制效率分别为66%和37%,HSA刺激转染pSUPER EGFP-C1、pSU-PER EGFP-C2的HKC后cubiin mRNA水平较正常对照组比较分别下降50%、34%,转染了重组质粒的HKC对白蛋白的摄取明显减少.结论 成功地构建了针对人cubilin基因的RNA干扰真核表达载体,表达型siRNA可抑制肾小管上皮细胞cubilin基因的表达及对白蛋白的摄取.
关键词： cubilin RNA干扰 siRNA 人近端肾小管上皮细胞 -
醛固酮诱导人肾小管上皮细胞胶原Ⅰ、Ⅲ表达的研究
目的：探讨Rho激酶对醛固酮（ALD）诱导的人肾小管上皮细胞胶原Ⅰ、Ⅲ（COL Ⅰ、Ⅲ）表达的影响。方法将人肾小管上皮细胞 HK‐2培养于含15％胎牛血清（FBS）的RPMI‐1640培养液中，ALD受体拮抗剂依普利酮（10μmol／L）和Rho激酶抑制剂Y27632（1μmol／L）预处理细胞30 min后，100 nmol／L ALD作用 HK‐2细胞24 h ，实时定量 PCR法检测各组细胞中COLⅠ、Ⅲ mRNA的表达，酶联免疫吸附试验测定培养上清液中COL Ⅰ、Ⅲ及Rho激酶蛋白表达水平。结果 ALD可上调HK‐2细胞中COL Ⅰ、Ⅲ mRNA的表达，并增加培养上清液中Rho激酶、COL Ⅰ、Ⅲ蛋白表达水平，Rho激酶抑制剂Y27632及ALD受体拮抗剂依普利酮可拮抗上述效应。结论 ALD可活化 HK‐2细胞Rho激酶信号传导通路，并通过Rho激酶诱导 HK‐2细胞COL Ⅰ、Ⅲ的表达而加速肾小管间质纤维化的进展。
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IFN-γ对培养的人近端肾小管上皮细胞表达PD-L1的影响
目的了解培养的人近端肾小管上皮细胞株HK2细胞程序性死亡配体-(PD-L1)的表达及其影响因素.方法RT-PCR、流式细胞计数和免疫细胞化学染色法.结果正常的HK2细胞表达少量PD-L1 mRNA和蛋白,200 ng/mLIFN-γ刺激24h后其表达升高,并持续至72 h;不同质量浓度的IFN-γ(50、100、200 ng/mL)刺激HK2细胞24h后,PD-L1表达呈剂量依赖性升高,与对照组比较差异显著(P＜0.01).结论IFN-γ刺激培养的HK2细胞表达PD-L1升高,推测HK2细胞上表达的PD-L1有可能和T细胞上的受体PD-1结合,影响肾小管间质的发病.
关键词： 人近端肾小管上皮细胞 IFN-γ 程序性死亡配体-1
