肝癌相关基因差异表达分析

为了研究肝癌发生和发展的分子机理,用cDNA Microarray 技术比较肝癌(HCC)和癌旁组织(nonHCC)基因差异表达情况,并选择4 个差异表达基因用RT-PCR验证.在1176个肿瘤相关基因中,491个在HCC中表达,345个在nonHCC中表达.HCC中表达上调的基因172个,表达下调的基因89个,RT-PCR结果与cDNA Microarray的结果基本一致.差异表达多的基因是与细胞信号传导和细胞分裂相关的基因.肝癌中生长因子及其受体相关基因表达上调,Ras-Raf-MAPK信号传导途径活化,与细胞周期相关基因的异常表达加速了细胞分裂进程.所有这些变化与肝癌的发生和发展密切相关.

人鼻型NK/T细胞淋巴瘤表达谱基因芯片的筛查研究

Ko等[1]对7例鼻型NK/T细胞淋巴瘤进行了比较基因组杂交和杂合性缺失分析,发现在染色体2q、3q、5q、10q、13q、17q和21q等处有DNA拷贝数增加;而在1p、17p、6q、12q和13q有基因缺失.Oka等[2]对NK/T细胞淋巴瘤细胞系NK-YS作了初步的基因芯片检测,发现蛋白酪氨酸蛋白磷酸酶SHP-1基因表达下调.本研究旨在初步筛选和观察部分肿瘤相关基因差异性表达的情况.

乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒反式调节靶基因的抑制性消减杂交和基因芯片分析结果的比较

目的:筛选与克隆HBV和HCV蛋白反式调节靶基因,阐明HBV和HCV感染后慢性肝脏疾病的发病机制.方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及表达谱基因芯片(cDNA microarray)技术筛选并克隆HBV和HCV蛋白反式调节的靶基因.以HBV和HCV蛋白的表达质粒转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.同时进行表达谱基因芯片技术分析.结果:成功构建人HBV和HCV蛋白反式调节基因差异表达的cDNA消减文库,对HBV和HCV蛋白反式调节的靶基因同时进行基因表达谱芯片的分析.在SSH分析中,文库扩增后均得到200-800 bp插入片段.对插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列.对于不同的肝炎病毒蛋白反式调节的靶基因类型,以及不同的分析技术研究的结果进行比较分析,发现了一系列的共同调节的靶基因,说明不同的肝炎病毒蛋白反式调节具有共同的作用途径.结论:筛选到的反式调节靶基因,包括一些与细胞生长调节、信号转导、肿瘤免疫发生及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因,推测了HBv和HCV蛋白可能存在的调控机制,有助于阐明HBV和HCV蛋白的反式调节在慢性肝脏疾病的发生发展中的作用.

应用表达谱芯片技术对乙型肝炎病毒前-S2抗原结合蛋白S2-29反式调节基因的研究

目的:应用基因表达谱芯片技术,研究未知功能的乙型肝炎病毒(HBV)前-S2(preS2)抗原肝细胞结合蛋白基因S2-29过表达,对HepG2细胞的基因表达的影响.方法:应用酵母双杂交技术筛选并验证HBV前-S2的肝细胞结合蛋白基因.反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从HepG2细胞中扩增S2-29蛋白编码基因片段,经测序鉴定后构建表达载体pcDNA3.1(-)-S2-29,应用基因表达谱芯片技术对pcDNA3.1(-)-S2-29转染的人肝母细胞瘤细胞系(HepG2)细胞和转染空载体的相同细胞的差异表达mRNA进行检测和分析.结果:筛选出肝文库中HBV前-S2结合蛋白S2-29的编码基因,构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定鉴定正确.提取转染细胞的总mRNA并进行逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1152个基因表达谱的筛选中,发现有9个基因表达水平显著下调,包括真核翻译延伸因子2、MAP激酶激活的死亡域、谷胱甘肽过氧化物酶、肌动蛋白、NDRG、Prosaposin、SUMO-1激活酶亚基1、胰岛素受体和1个未知功能蛋白.1个未知蛋白编码基因的表达上调.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了HBV前-S2结合蛋白S2-29蛋白的反式调节基因,为进一步阐明S2-29蛋白对细胞表达调控的影响提供了新的依据.

应用基因表达谱芯片技术筛选HBV前-S2蛋白反式调节基因

目的:乙型肝炎病毒(HBV)前-S2蛋白是由HBV S基因编码的具有多种功能的蛋白质.前-S2蛋白的表达对于HBV感染肝细胞的基因表达谱具有显著影响.为了研究前-S2蛋白反式调节的靶基因,我们应用基因芯片技术对于pcDNA3.1(-)和pcDNA3.1(-)-preS2分别转染的HepG2细胞的基因表达谱进行分析.方法:以含有HBV全基因组的质粒G376-7(GenBank号:AF384371)作为模板,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增前-S2蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术构建表达载体pcDNA3.1(-)-preS2.以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较.结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误,提取高质量的总mRNA并进行逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1152个基因表达谱的筛选中,发现有42个基因表达水平显著上调,36个基因表达水平显著下调.结论:HBV的前-S2蛋白是一种反式激活因子,前-S2基因的表达对于肝细胞基因表达谱有显著影响.

肠型胃癌基因表达的cDNA微阵列分析

目的:研究肠型胃癌发生发展的基因表达变化.方法:利用肠型胃癌和相应非癌组织的mRNA通过逆转录方法,将Cy3和Cy5两种荧光分别标记到两种cDNA上制成探针,然后与表达谱芯片(含4096条基因)进行杂交后扫描,通过计算机辅助判别基因的差异表达.结果:肠型胃癌和相应非癌组织组织中差异表达的基因有666条,上调表达333条,下调表达333条.参与细胞增生、凋亡、分化和转移调控的多种基因的表达水平发生了明显改变.结论:高通量、高灵敏度的cDNA微阵列芯片技术提供了全面了解肠型胃癌基因表达谱的新思路,一些与肿瘤发生相关的差异表达基因有可能发展成为生物标记物或肿瘤早期诊断和治疗的靶点.

Objective: A single mechanistic pathway cannot explain the genesis of drug resistance in cancer. Drug resistance in cancer is a major obstacle to successful chemotherapy. KB cells provide a useful starting point for selection of the multidrug resistant (MDR) cell lines. Methods: We used cDNA microarrays containing 12,720 sequences of known genes, expressed sequence tags and unknown clones to monitor gene expression profiles in MDR KB cells. Results: Preliminary data analysis showed that 18 genes were up-regulated and 18 genes were down-regulated by comparison of expression patterns between KB 3-1 and MDR KB-V1 cells. Furthermore, the highly over-expressed CGA, CLU genes in MDR KB-V1 cell were verified with conventional Northern blot analysis. These genes contain information predictive of drug resistance of cancer cells. Conclusion: Our study demonstrates that genome-wide gene expression profiling by using cDNA microarray technique is a valuable approach in obtaining molecular mechanism of drug resistance in cancer cells.

To study the gene expression of high metastatic human ovarian carcinoma cell line (HO-8910PM) and to screen for novel metastasis- associated genes by cDNA microarray. Methods: The cDNA was retro-transcribed from equal quantity mRNA derived from tissues of highly metastatic ovarian carcinoma cell line and normal ovarian, and was labeled with Cy5 and Cy3 fluorescence as probes. The mixed probes were hybridized with BioDoor 4096 double dot human whole gene chip. The chip was scanned by scanArray 3000 laser scanner. The acquired image was analyzed by ImaGene 3.0 software. Results: By applying the cDNA microarray we found: A total of 323 genes whose expression level were 3 times higher or lower in HO-8910PM cell than normal ovarian epithelium cell were screened out, with 71 higher and 252 lower respectively. Among these 10 were new genes. 67 genes showed expression difference bigger than 6 times between HO-8910PM cell and normal ovarian epithelium cell, among these genes 12 were higher, 55 lower, and two new genes were found. Conclusion: cDNA microarray technique is effective in screening the differentially expressed genes between human ovarian cancer cell line (HO-8910PM) and normal ovarian epithelium cell. Using the cDNA microarray to analyze of human ovarian cancer cell line gene expression profile difference will help the gene diagnosis, treatment and protection.

NF-H基因参与K562/A02细胞多药耐药机制形成的研究

目的分析K562/A02细胞多药耐药性(MDR)分子机制,寻找可能参与K562/A02细胞耐药机制的新基因.方法通过长期逐步增加K562细胞培养液中阿霉素(ADM)的浓度,诱导出多药耐药细胞株K562/A02,利用cDNA microarray比较K562和K562/A02基因表达的差别,从中选择NF-H基因进行RT-PCR和免疫细胞化学验证,并利用反义核酸技术和细胞内ADM浓度的测定,进一步验证该基因与K562/A02细胞多药耐药的关系.结果通过比较发现,有12个基因可能参与了K562/A02细胞的耐药机制,其中7个基因在K562/A02中被下调,5个基因被上调.本研究结果显示,NF-H基因在K562/A02细胞中高表达,并且,将NF-H和mdr1反义核酸同时转入K562/A02细胞后,可明显提高细胞内ADM浓度,而单独转入NF-H反义核酸效果不明显.结论 K562/A02细胞耐药表型的形成是多因素的,除了P-糖蛋白(P-gp)等常见因素外,可能还有NF-H基因的参与.