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CDR3δ2基因修饰γδT细胞的构建及其功能鉴定
目的 将全长p链mRNA和肿瘤反应性CDR3移植的δ2链mRNA共转染到抗CD3抗体刺激的PBMC,制备CDR3δ2基冈修饰型γδ T淋巴细胞,研究其抗肿瘤作用.方法 通过PCR扩增含有肿瘤反应性特异CDR3δ2序列(OT3和OT10)的TCR δ2链及γ9链,构建重组质粒pGEM4Z/δ2(OT3)/A64、pGEM4Z/ δ2(OT10)/ A64和pGEM4Z/γ9/ A64;以线性化的重组质粒作为模板,体外合成δ2(OT3)、δ2(OT10)和γ9 mRNA;将δ2(OT3)mRNA和δ2(OT10) mRNA分别与 γ9 mRNA共电转染入抗CD3抗体刺激的正常人PBMC;经流式细胞术检测和分选pδ2(OT3)T细胞和γ%2(T10)T细胞.ELISA及MTT法分别检测上述转染细胞的抗肿瘤作用.结果 CDR3δ2基因修饰的TCRγδ细胞pδ2(OT3)T细胞和γ9δ2 (T10)T细胞能够分泌较高的IFN-γ及TNF-α(P＜0.05),对多种肿瘤细胞具有显著的细胞毒作用(P＜0.05).结论 基因修饰型pδ2 T细胞能够明显增强对肿瘤的杀伤活性,为肿瘤过继免疫细胞的制备提供了新的策略.
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抗人γδ TCR单链抗体G5-4ScFv的制备及生物学功能分析
目的 构建并应用原核表达体系表达能体外刺激人γδ T细胞增殖的抗人γδ TCR单链抗体.方法 在成功建立稳定分泌鼠抗人γδTCR单克隆抗体杂交瘤细胞系G5-4的基础上,通过RT-PCR,扩增得到该单克隆抗体的重链(VH)和轻链(VL)可变区基因；通过搭桥PCR法,用连接肽(Gly4Ser)3,将VH和VL连接起来,构建了抗人γδ TCR单链抗体G5-4ScFv基因.将该基因插入原核表达载体pET22b(+),并在大肠杆菌TransB( DE3)中经IPTG诱导表达.通过SDS-PAGE,Werstern blot进行鉴定,并通过流式、固相扩增、细胞因子检测、杀伤检测等方法分析单链抗体G5-4ScFv的生物学功能.结果 单链抗体G5-4ScFv的相对分子质量约30ku,能与γδ TCR特异结合；固相化能刺激人PBMC中γδT细胞增殖,2周时其纯度可达90％；扩增得到的γδT细胞能有效杀伤肿瘤细胞系,如Daudi细胞,并在刺激时能有效分泌IFN-γ和TGF-α.结论 成功构建并表达了具有生物学活性的抗人γδ TCR单链抗体G5-4ScFv,为进一步研究其用于制备肿瘤过继免疫治疗用细胞制剂奠定了基础.
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γδTCRT细胞和CD1a分子在胸腔积液和外周血中阳性表达的临床研究
目的 探讨免疫分子CD1a和γδTCRT细胞在胸腔积液以及外周血中的阳性表达,提高临床鉴别诊断的水平.方法应用流式细胞仪分别检测34例结核性胸膜炎并胸腔积液、31例恶性肿瘤性胸腔积液患者外周血和胸腔积液中CD1a和γδTCRT的阳性表达,对照组21人.结果两组患者及对照组外周血中CD1a+、γδTCRT+的差异无统计学意义(t=0.01～1.79,P＞0.05).恶性肿瘤性胸腔积液中CD1a+、γδTCRT+的明显高于结核性胸腔积液(t=21.96～22.78,P＜0.001),也明显高于其外周血(t=21.32～24.19,P＜0.001).结论 胸腔积液中CD1a+、γδTCRT+可作为良、恶性胸腔积液鉴别诊断的参考依据.
