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蒺藜皂苷对人肝癌细胞BEL-7402生长抑制和诱导凋亡作用的研究
目的:探讨蒺藜皂苷(STT)对体外培养的人肝癌细胞BEL-7402的增殖抑制作用及诱导凋亡作用.方法:应用MTT与SRB法检测蒺藜皂苷对人肝癌细胞BEL-7402的抑制作用,采用形态学观察以及流式细胞术(FCM)检测了STT诱导人肝癌细胞BEL-7402凋亡的效应,采用流式细胞术检测BEL-7402细胞Bcl-2蛋白表达.结果:①STT能够剂量依赖地抑制人肝癌细胞BEL-7402的增殖;②细胞显现典型的凋亡形态学改变,FCM出现凋亡峰;③STT能降低BEL-7402细胞的Bcl-2蛋白表达.结论:STT在体外能抑制BEL-7402细胞的增殖并能诱导细胞凋亡,其诱导凋亡作用的途径之一是下调Bcl-2蛋白表达.
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刺梨不同提取部位对人类肝癌细胞株(HepG2)胆固醇代谢的影响
刺梨Rosa roxburghii Tratt.为蔷薇科属野生植物,用于治疗积食腹胀、肠炎痢疾、维生素C缺乏症等.刺梨含维生素C、维生素E、超氧化物歧化酶(SOD)、多糖,以及β-谷甾醇、原儿茶酸、委陵菜酸、euscaphic acid、硬脂酸和廿一烷酸等成分[1].具有清除自由基、增强机体免疫力、防动脉粥样硬化、抗细胞突变和抗癌等药理作用[2],此外还有明显的降血脂作用[3].本实验以人类肝癌细胞系HepG2为模型,测定刺梨各部位对细胞胆固醇合成与代谢的影响,以筛选刺梨降血脂作用有效成分或有效部位,为进一步开发刺梨降血脂药用部位奠定基础.
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乙型肝炎病毒和黄曲霉素协同作用诱发人肝细胞癌细胞株的建立
为了研究人乙型肝炎病毒(HBV)和黄曲霉素(AFB1)在肝癌发生过程中的作用,我们用HBV感染的人肝胎肝细胞移植至裸鼠背部皮下,以后每周皮下注射AFB1,在裸鼠体内成功地诱发了人肝细胞癌.选3只裸鼠所形成的种瘤组织,分别再接种裸鼠传代.在裸鼠体内传至5代后,将瘤组织在体外培养、传代,建立了3个肝癌细胞株,分别为CBH-1a、CBH-1b和CBH-2.对3个细胞株进行生物学持性分析发现,细胞生长迅速,接触抑制消失,细胞增殖核计数Ki67阳性细胞占38.2%.用EMA单抗检测证实为人来源细胞.核酸原位杂交显示,细胞中HBV-X和HBV-s基因阳性,PCR可扩增出X基因,证明HBV基因已到瘤细胞中.3个细胞株细胞再接种裸鼠皮下,可再生成肿瘤.此实验证明了HBV协同AFB1在人肝细胞癌发生过程中的病因作用.同时,为进步研究HBV和AFB1在肝癌发生过程中的分子机制提供了细胞水平的模型.
关键词： 人胚胎肝细胞 乙型肝炎病毒 黄曲霉素(AFB1) 肝癌细胞株 -
体外培养的不同亚型肝癌细胞差异蛋白的初步筛查
目的分析体外培养的不同亚型肝癌细胞株蛋白质表达差异,筛选肝癌的标志蛋白.方法采用表面增强激光解吸离子化(SELDI)蛋白质芯片技术检测了两种肝癌细胞株(肝细胞癌,SMMC-7721和肝内胆管细胞癌,IHCCC-9810)以及正常肝细胞(L102)的蛋白质谱.选用阴离子交换柱处理上述细胞总蛋白,用6种不同pH的洗脱液洗脱柱床,通过改变洗脱液的pH值将总蛋白分成不同pI范围的6组.每个组分用WCX2和IMAC3两种芯片检测.采用PBSII-C型蛋白质芯片阅读机读取数据,获得的数据采用Ciphergen公司的Proteinchip Software3.0.2软件分析.结果与L02细胞相比,有12个蛋白质在两种肝癌细胞株中均出现明显的变化,其中4个差异蛋白在肝癌细胞中高表达,8个差异蛋白在肝癌细胞中低表达.在对两种肝癌细胞株的蛋白质谱比较时发现,不同亚型的肝癌细胞有其各自的标志蛋白,其中11个蛋白分子在SMMC-7721细胞中高表达;在IHCCC-9810细胞中7个蛋白分子高表达,10个蛋白分子低表达.结论不同亚型肝癌细胞与正常肝细胞蛋白质谱比较时有共同的差异蛋白,同时不同亚型肝癌细胞之间的蛋白质谱表达也有差别.
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Hyper-IL-6基因转染的肝癌细胞株的建立及生物学特性的观察
IL-6是一种具有广泛生物学活性的细胞因子,近年曾有学者应用基因瘤苗的方法治疗肿瘤并取得一定的效果.Hyper-IL-6是Fischer等依据已知的关于IL-6受体的结构信息设计的一种“设计细胞因子”,即将人类IL-6基因与截短形式的可溶性IL-6受体基因通过基因操作共价连接,并在真核细胞进行表达得到的一种具有超高效IL-6活性的融合蛋白.本研究我们建立了稳定表达Hyper-IL-6的小鼠肝癌细胞克隆株,同时观察其生物学特性的改变.
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去蛋氨酸环境中多种化疗药对肝癌细胞株的杀伤作用
目的探索肝癌细胞和肝细胞在缺乏蛋氨酸环境中的生长状况和去蛋氨酸状况与多种化疗药物联合应用是否可增加对肝癌细胞的杀伤作用.方法将肝癌细胞株BEL-7402、肝细胞株L-02分别置于不含蛋氨酸含同型半胱氨酸培养基(Met-Hcy+)和含蛋氨酸不含同型半胱氨酸培养基(Met+Hcy-)中培养,MTT法检测两组细胞增值状态及在不同培养基中分别加入ADM、CDDP、5-FU、MMC和MTX化疗药物后,对各组细胞生长的抑制程度.结果L-02在Met-Hcy+和Met+Hcy-中生长无差异;Met-Hcy+未增加5-FU、ADM、CDDP、MMC和MTX对L-02的毒性作用.与Met+Hcy-组相比,在Met-Hcy+培养基中BEL-7402细胞生长受抑.Met-Hcy+与5-FU相结合可显著提高对BEL-7402细胞的杀伤作用,与ADM、CDDP、MMC和MTX结合未提高对BEL-7402细胞的杀伤作用.结论肝癌细胞BEL-7402细胞具有Met依赖性.Met-Hcy+与周期特异性化疗药物5-FU相结合可显著提高其对肝癌细胞BEL-7402的杀伤作用.
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蛋氨酸对肝癌细胞生长影响的实验研究
目的观察蛋氨酸对肝癌细胞和肝细胞生长的影响.方法将肝癌细胞株BEL-7402、肝细胞株L-02分别置于不含蛋氨酸而含同型半胱氨酸培养基(Met-Hcy+)和含蛋氨酸而不含同型半胱氨酸培养基(Met+Hcy-)中培养,利用细胞计数和流式细胞仪检测两组细胞增殖状态,观察蛋氨酸对各组细胞生长的影响.结果肝细胞株L-02在Met-Hcy+和Met+Hcy-中生长无差异,细胞总数及处于各细胞周期细胞数量的比例无明显差异.与Met+Hcy-组相比,在Met-Hcy+培养基中的BEL-7402细胞生长受抑,G0G1期细胞比例下降,S期细胞比例升高.结论培养基中缺少蛋氨酸,肝癌细胞株BEL-7402的生长受到抑制.
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青蒿琥酯诱导人肝癌细胞株HepG2凋亡及其机制
目的 探讨青蒿琥酯作用人肝癌细胞株HepG2后,对细胞凋亡的影响.方法 常规培养人肝癌细胞株HepG2,设立空白对照组、青蒿琥酯不同浓度组(3.125μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml),对HepG2作用48 h后,应用流式细胞术检测细胞凋亡率,同时采用瑞氏染色法观察细凋亡;用RT-PCR检测caspase-3 mRNA的表达,采用灰度分析比较表达的变化.结果 青蒿琥酯(3.125μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml)处理HepG2细胞48 h,呈浓度依赖性诱导细胞凋亡,且当青蒿琥酯浓度在6.25μg/ml以上时,各组凋亡率与对照组比较差异具有统计学意义(P＜0.01),瑞氏染色后光镜下可见处理组细胞发生凋亡形态学改变.与对照组比较,各实验组caspase-3的表达显著增加(P＜0.01).结论 青蒿琥酯能显著诱导HepG2细胞凋亡,其机制可能与增强凋亡相关基因caspase-3的表达有关.
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siRNA靶向干扰GPC3基因慢病毒载体的构建及其对肝癌Huh-7细胞凋亡的影响
目的：构建GPC3基因短发夹干扰RNA（shRNA）慢病毒载体，观察GPC3基因对人肝癌细胞系Huh-7凋亡的影响，探讨GPC3基因影响肝癌细胞生长的机制，为肝癌的基因治疗提供理论基础。方法采用RNA干扰技术转染肝癌细胞系Huh-7，荧光定量 PCR检测GPC3基因在多种肝癌细胞株中的表达情况。构建重组靶向GPC3基因的小干扰RNA序列PGC-shRNA-GPC3，以脂质体（lipofectamineTM2000）为载体转染人肝癌细胞系，筛选并建立稳定表达 siRNA的细胞株。采用RT-PCR及Western blot检测GPC3 siRNA转染后mRNA表达情况，验证siRNA的干扰效率。流式细胞仪检测阴性对照组、未转染组和转染组细胞凋亡的情况。结果在肝癌细胞株Huh-7中， GPC3基因显示高表达。测序验证 PGC-shRNA-GPC3重组质粒构建成功。将重组质粒稳定转染入肝癌细胞株Huh-7后能明显抑制GPC3 mRNA表达水平；同时，流式细胞仪检测发现，GPC3表达下调后，诱导Huh7细胞的凋亡。结论靶向GPC3的siRNA能有效抑制GPC3的表达，并能促进肝癌Huh7细胞凋亡。
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肝细胞癌中XIAP mRNA及蛋白表达的意义
目的:通过检测XIAP mRNA及蛋白在肝细胞癌中的表达程度,探讨XIAP在原发性肝细胞癌发生中的作用.方法:应用RT-PCR技术检测正常肝细胞株L-02,肝癌细胞株SMMC7721,HepG2和30例肝癌及其相应癌旁组织中XIAP mRNA的水平,同时应用免疫组织化学方法检测了上述细胞株及组织中XIAP蛋白的表达.结果:三株细胞株均有XIAP mRNA的表达,XIAP/β-actin均值分别为L-02:0.418±0.045,SMMC7721:0.719±0.069,HepG2:0.654±0.055.其中L-02细胞株的XIAP mRNA水平显著低于SMMC7721及HepG2(P＜0.05),两株肝癌细胞株的XIAP mRNA表达无显著性差异(P＞0.05).三株细胞亦均有XIAP蛋白的表达,其细胞爬片平均光度分别为0.158±0.016,0.291±0.022,0.238±0.011,三株细胞的XIAP蛋白水平存在显著性差异(P＜0.05).肝癌组织XIAP mRNA表达较癌旁组织显著升高,XIAP/β-actin均值分别为:0.587±0.064,0.313±0.059(P＜0.05).免疫组化染色显示:XIAP蛋白表达主要集中在肝细胞胞质中,其在肝癌组织中的表达显著高于癌旁组织,平均光度分别为:0.276±0.054,0.095±0.014(P＜0.05).结论:XIAPmRNA及其蛋白在肝癌组织及肝癌细胞系中表达水平明显升高,提示他可能是促进肝细胞恶变的一个重要因素.
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siRNA沉默Cyclin E基因对肝癌HepG2、SMMC-7721和BEL-7402细胞增殖和侵袭能力的影响
目的:观察siRNA沉默Cyclin E基因表达对肝癌HepG2、SMMC-7721和BEL-7402细胞增殖和侵袭能力的影响.方法:构建2个靶向Cyclin E基因siRNA载体,转染人肝癌HepG2、SMMC-7721和BEL-7402细胞.RT-PCR、Western blot检测转染后HepG2、SMMC-7721和BEL-7402细胞Cyclin E基因mRNA和蛋白表达水平.CCK-8试验、软琼脂克隆形成实验检测HepG2、SMMC-7721和BEL-7402细胞增殖、克隆形成能力.流式细胞术、transwell试验分别检测HepG2、SMMC-7721和BEL-7402细胞周期和侵袭能力.结果:构建的2个Cyclin E基因siRNA载体插入序列与所设计序列均一致；转染HepG2、SMMC-7721和BEL-7402细胞后,干扰1组、干扰2组与空白对照组和阴性对照组比较,Cyclin E mRNA和蛋白表达量均显著降低(P＜0.05),细胞生长速度延缓,软琼脂细胞集落形成数、穿透细胞数均显著降低(P＜0.05),S和G2/M期细胞比例减少,G0/G1期细胞比例增加.结论:沉默肝癌细胞Cyclin E表达水平,可有效抑制细胞生长、增殖和侵袭能力.
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体外培养的肝癌细胞株与正常肝细胞株蛋白质的差异表达
目的:运用SELDI蛋白质芯片技术分析体外培养的肝癌细胞株(HepG2)与正常肝细胞株(L02)蛋白质表达差异.方法:在体外培养HepG2和L02细胞株,收获细胞,将细胞用细胞裂解液裂解后,采用SELDI蛋白质芯片技术用IMAC3及WCX2芯片检测HepG2、L02的蛋白质谱.结果:体外培养的肝癌细胞株与正常肝细胞株的蛋白质存在差异表达,IMAC3芯片共捕获61个蛋白,发现差异峰7个,与L02细胞相比,其中3个差异蛋白在肝癌细胞中高表达,4个差异蛋白在肝癌细胞中低表达.WCX2芯片共捕获91个蛋白,发现差异峰14个,其中3个差异蛋白在肝癌细胞中高表达,11个差异蛋白在肝癌细胞中低表达.结论:SELDI蛋白芯片技术检测肝癌细胞株与正常肝细胞株蛋白质的差异表达方法简便,敏感性高,重复性好.
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IL-2联合IL-12激活A-NK细胞治疗人肝癌HepG-2
目的:研究A-NK细胞体外抗肿瘤作用及小鼠体内抗肿瘤作用.方法:用淋巴细胞分离液分离健康人外周血中的血单个核细胞,PME(5 mmoL/L)室温处理40 min,PME处理后的人外周血单个核细胞重悬于AIMV中.分为四组分别为:IL-2(6 MU/L)组,IL-2(1MU/L)组,IL-12(5 ug/L)组,IL-2(1 MU/L)+IL-12(5 ug/L)组;每瓶细胞浓度为5×109/L,于37℃,50 mL/L CO2饱和湿化空气的培养箱中水平培养4-5 h,移去含未黏附于塑料表面的细胞悬液,收集黏附于塑料表面的细胞(即A-NK细胞),MTT比色法检测A-NK细胞体外细胞毒作用;然后建立肝癌细胞株裸鼠皮下移植瘤模型,以肿瘤体积、抑瘤率、生存期等指标观察A-NK对移植瘤的抑制作用.结果:A-NK+IL-2+IL-12组细胞毒活性明显高于其他三组(aP＜0.05),体内实验表明A-NK+IL-2+EL-4/IL-12治疗组的移植瘤生长速度缓慢,体积明显小于生理盐水对照组(bP＜0.05),生存期显著延长(cP＜0.05).结论:IL-12辅助IL-2激活的A-NK细胞的体外杀伤活性较单独用IL-2或IL-12强,体内实验显示具有明显的抗肿瘤作用.
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干扰素-α对人肝癌细胞增殖及侵袭的抑制作用
目的:研究人干扰素-α对人肝癌细胞系BEL-7402细胞增殖及侵袭的抑制作用.方法:常规培养的BEL-7402细胞加入人干扰素-α(1×106U/L)共同孵育24 h后,以MTT法检测干扰素-α对肿瘤细胞增殖的影响;Boyden小室法检测肝癌细胞侵袭能力的变化;明胶酶谱法检测肝癌细胞基质金属蛋白酶的变化.免疫组化法检测肿瘤细胞增殖核抗原的表达;TUNEL法检测肿瘤细胞的凋亡.结果:人干扰素-α可以明显抑制体外BEL-7402细胞的增殖(抑制率为20.2%);干扰素-α作用后在Boyden小室穿膜的肿瘤细胞数明显减少(抑制率为23.9%);肝癌细胞基质金属蛋白酶的分泌没有明显变化.干扰素-α组肿瘤细胞增殖核抗原的表达明显下降,凋亡细胞数明显增加.结论:低剂量的干扰素-α可以直接抑制肝癌细胞株BEL-7402的增殖,对BEL-7402细胞的侵袭有明显的抑制作用;可以抑制肿瘤细胞增殖核抗原的表达并诱导细胞凋亡.
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抑癌基因p27Kip1对肝癌细胞增生及DNA合成的影响
目的:探讨抑癌基因p27Kip1对肝癌细胞的抑制作用.方法:利用脂质体介导法将真核表达载体pcDNA3.1/MycHis(+)C-p27Kip1基因导入肝癌细胞株HHCC细胞中,经G418筛选获得稳定表达的细胞克隆,用MTT、3H-TdR掺入法和克隆形成实验观察抑癌基因p27Kip1对肝癌细胞增生及DNA合成的影响,电子显微镜技术探讨过表达的p27Kip1抑制肝癌细胞生长的可能机制.结果:抑癌基因p27Kip1对肝癌细胞增生及DNA合成均有明显抑制作用,抑制率达56%(P＜0.01 vs 转染空载体组),电镜结果显示肝癌细胞发生凋亡.结论:抑癌基因p27Kip1可能通过诱导肝癌细胞凋亡抑制肝癌细胞生长.
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鹅脱氧胆酸衍生物HS-1200诱导人肝癌细胞株凋亡的作用及机制
鹅脱氧胆酸衍生物HS-1200可有效地抑制肝肿瘤细胞株BEL7402的生长,其作用随药物浓度提高和作用时间延长而增强,呈一定的剂量、时间依赖性;鹅脱氧胆酸衍生物HS-1200对人肝肿瘤细胞株BEL7402有显著的生长抑制作用,该生长抑制作用与HS-1200诱导肝肿瘤细胞凋亡有关;HS-1200对正常肝细胞株无生长抑制及诱导凋亡的作用.HS-1200诱导凋亡的机制可能是HS-1200提升Bax而降低Bcl-2的表达,从而使线粒体膜通透性增高,使细胞色素C由线粒体释放入胞质,活化easpase-9,活化的caspase-9切割pro-caspase-3生成caspase-3,从而诱导凋亡;但上述凋亡过程caspase-8特异性抑制剂未改变HS-1200诱导的凋亡,因而HS-1200诱导肝肿瘤细胞凋亡途径为内源性凋亡途径.
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抑癌基因p27Kip1及其Ser10突变体对HepG2细胞周期和增生的影响
目的:p27kip1氨基端第10号位置的丝氨酸(Ser10)磷酸化位点是该蛋白分子中重要的磷酸化位点,探讨人工诱变该位点丝氨酸为丙氨酸(S10A)后对肝癌细胞株HepG2细胞周期以及细胞增生的影响.同时比较野生型p27kip1和Ser10突变型p27kip1基因转染对肝癌细胞株HepG2细胞周期和增生的影响.方法:应用脂质体转染法将含人野生型和突变型p27kip1质粒DNA瞬时转染HepG2细胞,免疫细胞化学检测p27kip1蛋白的表达和细胞内分布,流式细胞计数仪分析细胞周期变化.结果:野生型和突变p27kip1蛋白转基因后HepG2细胞均可以G0期阻滞,且突变型的阻滞作用强于野生型(P＜0.05),细胞生长受到抑制.无血清培养96 h同步化于G0期,野生型和突变型p27kip1均分布于细胞核;而在20 mL/L血清继续培养8 h后野生型向细胞质转运而主要分布于细胞质,突变型仍然滞留于细胞核.结论:p27kip1的过度表达可明显抑制HepG2细胞的增生,p27kip1 Ser10酸化可能介导其细胞核外转运的重要分子机制.
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靶向survivin的siRNA对肝癌细胞生物学行为的影响
目的:探讨转入靶向survivin的siRNA对肝癌细胞生物学行为的影响.方法:设计、合成一对survivin编码基因的反向重复序列,中间间隔9个核苷酸序列,通过定向克隆至载体PSilencer2.1,构建siRNA真核表达载体,经稳定转染HepG2细胞后对转基因后肿瘤细胞的生物学行为进行观察.结果:测序证实siRNA真核表达载体构建成功.通过RTPCR及流式细胞术检测,siRNA在mRNA及蛋白质水平抑制survivin基因表达分别达73%和75%.转染细胞生长速度明显减慢,凋亡率增加15倍.裸鼠体内成瘤率下降75%,9-30 d肿瘤体积分别为0.10±0.01 cm3,0.30±0.03 cm3,0.39±0.11 cm3,0.45±0.13 cm3,0.49±0.07 cm3,0.58±0.01 cm3,0.60±0.10 cm3,0.65±0.07 cm3,与对照组相比差异显著(P＜0.01).结论:靶向survivin的siRNA能有效降低目的基因的表达并能在体内体外抑制肝癌细胞株HepG2的生长.为进一步逆转肿瘤细胞的耐药性提供了理论指导.
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热休克蛋白70联合白介素-2对小鼠肝癌细胞株移植瘤的影响
目的:研究肿瘤热休克蛋白70联合应用IL-2对小鼠肝癌的治疗作用,为两种免疫制剂联合应用治疗人类恶性肿瘤提供参考依据.方法:应用细胞培养、蛋白提纯、电泳、Western-blot、毛细管电泳、动物实验等方法.小鼠分别用HSP70 10μg、5 μg和IL-2 50kU、100kU、2kU(维持量)按设计的方案进行治疗试验.结果:单纯应用或联合应用HSP70和IL-2均能明显地延缓小鼠移植肝癌的生长并能不同程度地延长生存期,与对照组相比(除IL-250kU组外)差异显著(P＜0.025-0.05).但获长期存活(＞90d)者仅见于接受HSP70 10 μ g治疗组,40%(2/5)的HSP70 10 μ g组及HSP70 10 μ g联合应用IL-2 50kU组小鼠,和60%(3/5)的HSP70 10 μg联合应用IL-2 100kU组小鼠,获长期生存的小鼠其肿瘤终全部消退.与无长期生存小鼠的其他组相比差异十分显著(P＜0.025-0.05).IL-2 100kU与HSP70 5 μ g的作用相当.结论:肿瘤来源的HSP70较IL-2具有更强的治疗作用,在联合应用实验的治疗组中HSP70对延缓和消除肿瘤起主要作用.更重要的是,合适剂量的HSP70与IL-2联合应用(本研究中HSP70 10 μg与IL-2 100kU)能明显地提高对荷瘤小鼠的治疗作用.
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肝细胞癌hOGG1 mRNA及其蛋白的表达
目的:通过检测DNA修复酶hOGGl mRNA及其蛋白在肝细胞癌中表达程度,探讨hOGGl在肝细胞癌发生、发展中的作用.方法:应用RT-RCR研究正常肝细胞株L-02、肝癌细胞株SMMC7721,HepG2和肝癌(26例)及癌旁组织(21例)中hOGGl mRNA的表达,同时用免疫组织化学方法检测了上述肝癌组织(17例)及癌旁组织(15例)中hOGGl蛋白的表达.结果:三株细胞均有hOGGl mRNA表达,但hOGGlmRNA在正常肝细胞株L-O2中的表达显著低于肝癌细胞株SMMC7721、HepG2中的表达(分别为0.270±0.014,0.66±0.011,0.624±0.020,P＜0.05).肝癌组织hOGGlmRNA表达较癌周组织明显降低(P＜0.05).HOGGl蛋白肝组织表达阳性率为87.2%,主要在肝细胞胞质表达,在肝癌组织中表达比癌周组织明显降低(P＜0.05).结论:hOGGlmRNA及其蛋白在肝癌细胞株及癌周组织中表达量升高,这可能是肝细胞癌恶性演变过程中的一个早期预警指标.
