首页 > 文献资料
-
结核病DNA疫苗的现状与未来
1990年Wolff等[1]在一次基因治疗的实验研究中意外地发现不加任何处理的基因也可在骨骼肌细胞中表达蛋白至少2月,从而产生了核酸疫苗或基因疫苗、基因免疫、核酸免疫的全新概念,开创了免疫学和疫苗学的新领域.核酸疫苗包括DNA疫苗和RNA疫苗,由能引起机体保护性免疫反应的病原体抗原的编码基因和真核表达载体构建而成,它被注入机体后,通过宿主细胞的转录系统表达蛋白抗原,诱导宿主产生细胞免疫应答和体液免疫应答,从而达到预防和治疗疾病的目的.DNA疫苗可诱导全面的免疫反应,尤其是特异性CTL识别、杀伤、破坏被感染的细胞及清除细胞内的病原体,这对于清除寄生于巨噬细胞内的结核分支杆菌非常有意义.1996年以来WHO将结核病核酸疫苗研究列为资助的项目之一.本文概述了结核病DNA疫苗研究的现状,及其在结核病预防和治疗方面需进一步研究的问题和应用前景.
-
载脂蛋白M基因真核表达载体构建及其对HBV复制的影响
载脂蛋白(apolipoprotein,apo)是脂蛋白中的蛋白成分,主要由肝细胞合成,是正常脂蛋白颗粒的装配和分泌所必需的.载脂蛋白M(apoM)是高密度脂蛋白(HDL)胆固醇的主要成分之一,参与HDL的合成和分泌[1].研究表明HBV感染患者apoM血清学水平升高[2],但apoM能否影响HBV的复制还不清楚.本研究通过构建apoM的真核表达载体,探讨apoM对HBV复制的影响.
-
羧肽酶N调节乙型肝炎病毒核心启动子表达活性的研究
目的:乙型肝炎病毒(HBV)的感染,不仅引起急、慢性病毒性肝炎,而且与肝纤维化、肝细胞癌的发生发展密切相关.为深入研究HBV调节表达的机制,我们应用噬菌体展示技术,以HBV核心启动子DNA片段为固相支持物,筛选肝细胞cDNA文库,获得HBV核心启动子的肝细胞结合蛋白-羧肽酶N(CPN).CPN是一种从多肽和蛋白质C端氨基酸残基分离的血浆金属蛋白酶,他在调节激肽和过敏毒素的生物活性上起关键作用.CPN是分子量280 kD的四聚体,包含两个50KD酶性亚单位和两个83 kD调节亚单位.核心启动子产生两个3.5kb RNA:前-核心和前基因组RNA.前-核心RNA编码前-核心蛋白和e抗原,前基因组RNA不仅作为mRNA编码核心蛋白和聚合酶蛋白,而且与病毒蛋白一起包埋入核衣壳,作为模板逆转录.前基因组RNA的表达调控在病毒复制周期中起着关键作用.核心启动子分为两部分:基本核心启动子和核心上游调节元件(CURS),其上游为负性调节元件(NER,1616-1621 nt).CPD在体内与HBV核心启动子结合的作用还不清楚,我们分别构建HBV核心启动子及羧肽酶N的重组载体,通过脂质体转染NIH 3T3细胞,研究CPN对核心启动子的调节表达.方法:根据HBV核心启动子及羧肽酶N的序列设计引物,在核心启动子的引物两端引入MIu Ⅰ和Nhe Ⅰ的酶切位点,在羧肽酶N的引物两端引入EcoR Ⅰ和BamHⅠ的酶切位点.用聚合酶链反应(PCR)的方法分别扩增HBV核心启动子和羧肽酶N基因,克隆到pGEM-Teasy载体上.核心启动子经MIu Ⅰ和Nhe Ⅰ双酶切回收连接到同样酶切的pCAT载体上,羧肽酶N经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切回收连接到同样酶切的pcDNA3.1(-)质粒上,构建HBV核心启动子的报告载体及羧肽酶N的真核表达载体,脂质体法瞬时转染NIH 3T3细胞.结果:HBV核心启动子和羧肽酶N(CPN)的PCR产物经1%琼脂糖电泳鉴定与预期大小符合,分别为206 bp和580 bp.重组载体经双酶切鉴定后,证明HBV核心启动子的报告载体及羧肽酶N(CPN)的真核表达载体构建成功.脂质体法瞬时转染NIH 3T3细胞48 h后,用ELISA法检测β-gal的表达,显示核心启动子在羧肽酶N(CPN)的影响下,其活性有大约5-6倍的增加.通过体内实验证明羧肽酶N(CPN)可以上调HBV核心启动子的表达.结论:HBV核心启动子结合蛋白羧肽酶N(CPN)与HBV核心启动子共转染细胞,明显调节HBV核心启动子的表达,为进一步研究HBV复制的分子生物学机制提供了新的理论基础.
-
靶向survivin的siRNA对肝癌细胞生物学行为的影响
目的:探讨转入靶向survivin的siRNA对肝癌细胞生物学行为的影响.方法:设计、合成一对survivin编码基因的反向重复序列,中间间隔9个核苷酸序列,通过定向克隆至载体PSilencer2.1,构建siRNA真核表达载体,经稳定转染HepG2细胞后对转基因后肿瘤细胞的生物学行为进行观察.结果:测序证实siRNA真核表达载体构建成功.通过RTPCR及流式细胞术检测,siRNA在mRNA及蛋白质水平抑制survivin基因表达分别达73%和75%.转染细胞生长速度明显减慢,凋亡率增加15倍.裸鼠体内成瘤率下降75%,9-30 d肿瘤体积分别为0.10±0.01 cm3,0.30±0.03 cm3,0.39±0.11 cm3,0.45±0.13 cm3,0.49±0.07 cm3,0.58±0.01 cm3,0.60±0.10 cm3,0.65±0.07 cm3,与对照组相比差异显著(P<0.01).结论:靶向survivin的siRNA能有效降低目的基因的表达并能在体内体外抑制肝癌细胞株HepG2的生长.为进一步逆转肿瘤细胞的耐药性提供了理论指导.
-
小鼠甲胎蛋白基因的克隆真核表达载体构建及表达鉴定
目的:克隆小鼠甲胎蛋白(AFP)基因,构建小鼠AFP真核表达载体并进行表达鉴定.方法:从Hepal-6细胞中提取总RNA进行RT-PCR,克隆出小鼠AFP基因,亚克隆于pcDNA3.1载体,重组阳性克隆进行酶切和测序鉴定.重组质粒瞬时转染CHO-K1细胞,Western blot检测小鼠AFP的表达.结果:利用RT-PCR从Hepal-6细胞总RNA中成功克隆出1.8kb的小鼠AFP基因,重组阳性克隆经酶切和测序鉴定证实目的基因已正确插入pcDNA3.1载体中,Western blot结果证实重组质粒pmAFP能够在CHO-K1细胞中正确表达.结论:小鼠AFP真核表达载体构建成功,为进一步研究其在肝癌免疫治疗中的作用奠定了基础.
-
镇痛抗肿瘤肽基因真核表达载体构建及其体外抗肝细胞癌作用
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)在我国的发病率及病死率均高.西医治疗肿瘤有起效快的优点,但往往有较大的副作用和局限性.我国传统中药中许多成分具有抗肿瘤作用,作为中药蝎毒成分之一的东亚钳蝎镇痛抗肿瘤肽(analgesic-antitumor peptide,AGAP)近来备受关注,将其与现代生物技术结合开发新的抗肿瘤药物具有很好的发展前景.本研究通过构建甲胎蛋白(AFP)启动子及增强子调控的AGAP真核表达载体,观察其对HCC的治疗作用,为蝎毒在肝癌基因治疗方面的价值提供实验依据.
-
人LOX-1基因毕赤酵母表达载体的构建与表达研究
目的 构建血凝素样氧化低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)真核表达载体,筛选高表达菌株,为体外获得有活性重组蛋白奠定基础.方法 以实验室保存的含有人源LOX-1基因的质粒为模板PCR扩增LOX-1基因,经过TA克隆后亚克隆至酵母表达载体pPICZαA,将获得的重组质粒电转化至毕赤酵母X-33,利用原位双膜法快速检测阳性高表达菌株,后经过甲醇诱导,采用Western blot检测LOX-1的表达.结果 成功构建LOX-1真核表达载体,双膜法筛选到高表达菌株;Western blot结果显示,LOX-1在上清中得到表达.结论 LOX-1基因在毕赤酵母细胞上清中得到表达,为体外获得活性重组蛋白和研究其致动脉粥样硬化功能奠定基础.
-
大鼠pEGFP-C3/BMP-2真核表达载体的构建
目的 通过克隆大鼠的BMP2基因,构建EGFP-C3/BMP2基因的真核细胞表达载体.方法 把大鼠的基因组DNA通过PCR获得BMP2,克隆构建载体pEGFP/C3-BMP2,并将其转化到大肠杆菌里面,后进行重组真核表达载体pEGFP-C3-BMP2的构建和鉴定,并可观察其在真核细胞中的表达.结果 以大鼠总DNA为模板扩增出1 200 bp左右的特异性条带,测序结果与Gene-Bank测序结果相比,翻译成的氨基酸序列相同并完全一致,并可在真核细胞中表达.对重组质粒pEGFP-C3/BMP2进行双酶切鉴定并测序,结果也完全一致.结论 为进一步研究利用BMP2基因修饰骨组织工程骨,促进骨折愈合再生提供实验基础.
-
人IL-18基因真核表达载体的构建
目的:通过克隆人的Interleukin-18 基因,构建Interleukin-18 基因的哺乳动物细胞真核表达载体.方法:把人基因组DNA 通过PCR 获得Interleukin-18,克隆载体pMD18-T/Interleukin-18,并将其转化到大肠杆菌里,后进行重组真核表达载体pCDNA3.1/Interleukin-18的构建和鉴定.结果:以人总DNA 为模板扩增出580 bp左右的特异性条带,测序结果与GeneBank测序结果相比,除两个碱基外,其余的完全一致,翻译成的氨基酸序列相同.对重组质粒pCDNA3.1/Interleukin-18进行双酶切鉴定并测序,结果也完全一致.结论:重组质粒pCDNA3.1/Interleukin-18由真核载体pCDNA3.1和Interleukin-18 片段组成.且插入的Interleukin-18 片段与已知序列完全相同.
关键词: Interleukin-18基因 PCR 真核表达载体构建 -
乙型肝炎病毒DNA疫苗的研究现状
乙型肝炎(乙肝)病毒(HBV)DNA疫苗是指通过克隆HBV抗原基因,并将其插入真核表达载体构建而成的重组DNA分子.通过皮下、肌肉注射或颗粒轰击技术将重组DNA分子导入体内,使目的基因在体内表达,从而诱导机体产生针对此种抗原的体液免疫和细胞免疫.
-
EndoA基因真核表达载体构建及其对皮肤表皮细胞的作用
瘢痕组织是人体创伤修复过程中的一种自然产物,然而,胚胎皮肤却具有创伤后无瘢痕愈合的能力.近年来研究发现无瘢痕愈合是胚胎皮肤固有的特性[1],我们通过构建真核表达载体pcDNA 3.1/EndoA,并转染小鼠皮肤表皮细胞,研究EndoA对成鼠皮肤表皮细胞的作用.
-
活化的蛋白激酶C受体1真核表达载体的构建与鉴定
目的:构建活化的激酶C受体1( RACK1) WD1-4真核表达载体,通过细胞转染和Western blot鉴定其是否在细胞中表达.方法:应用PCR法扩增RACK1蛋白中第1~4个WD40区域的片段,将其与PGEM-T载体连接,测序后再将其克隆至pEGFP-N1中.采用脂质体法将重组质粒转染至293T细胞中,观察其在真核细胞中的表达,并用Western blot法进行鉴定.结果:pEGFP-N1-RACK1 (WD1-4)重组质粒经酶切鉴定及测序证实,目的基因的序列完全正确.荧光显微镜观察发现,转染了重组质粒的细胞株可见绿色荧光融合蛋白的表达,Western blot结果进一步证实了上述结果.结论:成功构建pEGFP-N1-RACK1 (WD1-4)重组质粒且进行了真核表达,为下一步研究RACK1蛋白的功能奠定了基础.
-
人lrg真核表达载体的构建和初步分析
目的:在真核细胞中表达人lrg基因.方法:构建野生型人lrg的真核表达载体,体外转染肝癌细胞系HepG2,并进行稳定筛选.用Western Blot、SABC-FITC进行人lrg基因表达的鉴定.结果:成功构建了人lrg的真核表达载体pcDNA3.1(+)/hlrg,Western Blot和SABC-FITC等实验表明该基因在HepG2中进行了表达.结论:在HepG2中稳定表达了pcDNA3.1(+)/hlrg,为深入探讨人lrg基因的功能奠定了基础.