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HBV X基因变异的生物学及临床意义
本文对近年来乙型肝炎病毒(HBV)重叠于X基因的基本核心启动子(BCP)双突变及X基因的缺失变异的生物学及临床意义的研究进展作了简要综述.
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HBV X基因变异的生物学及临床意义
本文对近年乙型肝炎病毒(HBV)重叠于X基因的基本核心启动子(BCP)双突变及X基因的缺失变异的生物学及临床意义的研究进展作了简要综述.
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乙型肝炎病毒基本核心启动子及前C区突变与基因型的关系
目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)基本核心启动子(BCP)及前C区突变与基因型之间的关系. 方法随机选取113例慢性HBV感染者外周血,采用INNO-LiPA法测定BCP T1762/A1764双突变及前C区A1896突变,测定HBV S基因序列明确基因型. 结果在C基因型感染者中BCP T1762/A1764双突变率明显高于B基因型感染者,差异有显著性(34.2%∶10%,χ2=6.74,P＜0.01),而前C区A1896突变率在B基因型和C基因型感染者中差异无显著性(2.5%∶4.1%,χ2=0.00,P＞0.05). 结论与B基因型相比,C基因型感染者更易发生BCP T1762/A1764双突变.
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C基因型乙型肝炎病毒前C区及基本核心启动子突变与疾病进展的相关性研究
目的 探讨HBV前C区(PreC)及基本核心启动子(BCP)突变与慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者疾病进展的关系.方法 收集88例慢性HBV感染者血清标本,包括36例无症状携带者(其中24例为HBV携带者,12例为HBsAg携带者)、36例慢性乙型肝炎(慢性乙肝)和16例肝硬化患者.所有标本均经型特异性引物PCR法鉴定为HBV C基因型,并用巢氏PCR法扩增HBV PreC和BCP基因片段,用PCR产物直接测序法测序,然后用Clustal W1.8软件进行序列分析.结果 在50例HBeAg阳性患者中,无症状携带者、慢性乙肝和肝硬化组的T1762/A1764双突变率和T1846突变率分别为12.5%、42.1%、100%和0%、5.3%、28.6%,差异均有统计学意义(P值分别为0.03和0.02).在38例HBeAg阴性HBV感染者中,无症状携带者、慢性乙肝和肝硬化组的T1762/A1764双突变率分别为16.7%、58.8%和66.7%,差异无统计学意义(P=0.08).肝硬化组的C/G1753突变率显著高于无症状携带者及慢性乙肝组(分别为55.6%、8.3%、11.8%,P=0.01),其A1896突变率也高于无症状携带者组(分别为55.6%、8.3%,P=0.01).结论 HBV T1762/A1764双突变与C基因型HBV慢性感染者的疾病进展有关.
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HBV慢性感染者前C/BCP区变异特点及与疾病发展关系分析
目的:探讨慢性HBV感染者前C/BCP区突变与血清HBeAg、HBsAg、DNA、甲胎蛋白(AFP)及肝硬度值(LSM)的关系及对疾病进展的预测性.方法:收集101例未经抗病毒治疗的慢性HBV感染者和47例乙型肝炎肝硬化(LC)患者清晨空腹血清.以免疫化学发光法检测血清HBeAg、HBsAg、AFP含量,采用磁珠法检测HBV-DNA,应用半巢式聚合酶链反应检测前C/BCP区基因突变,采用无创实时检测设备检测LSM.结果:101例慢性HBV感染者中,HBeAg阴性组的前C、BCP、前C+BCP区的变异率显著高于HBeAg阳性组(P<0.01).而LC组总变异率显著高于慢性HBV感染者HBeAg阴性组和HBeAg阳性组(P<0.01).148例HBV感染者中前C区、BCP区和前C+BCP变异株共87例,野生株61例,变异型组与野生型组比较,HBeAg含量减少(P<0.05),HBsAg含量增加(P<0.01),AFP水平和LSM值增高(P<0.05),DNA水平无统计学意义(P>0.05).结论:HBeAg阴性的慢性HBV感染患者中前C/BCP区变异率较高,变异可能导致更易发展为肝硬化,病情加重.监测HBeAg阴转的慢性HBV感染患者的DNA、HBsAg、AFP、LSM指标,对了解病情及体内病毒是否确实已被免疫清除有参考价值.
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羧肽酶N调节乙型肝炎病毒核心启动子表达活性的研究
目的:乙型肝炎病毒(HBV)的感染,不仅引起急、慢性病毒性肝炎,而且与肝纤维化、肝细胞癌的发生发展密切相关.为深入研究HBV调节表达的机制,我们应用噬菌体展示技术,以HBV核心启动子DNA片段为固相支持物,筛选肝细胞cDNA文库,获得HBV核心启动子的肝细胞结合蛋白-羧肽酶N(CPN).CPN是一种从多肽和蛋白质C端氨基酸残基分离的血浆金属蛋白酶,他在调节激肽和过敏毒素的生物活性上起关键作用.CPN是分子量280 kD的四聚体,包含两个50KD酶性亚单位和两个83 kD调节亚单位.核心启动子产生两个3.5kb RNA:前-核心和前基因组RNA.前-核心RNA编码前-核心蛋白和e抗原,前基因组RNA不仅作为mRNA编码核心蛋白和聚合酶蛋白,而且与病毒蛋白一起包埋入核衣壳,作为模板逆转录.前基因组RNA的表达调控在病毒复制周期中起着关键作用.核心启动子分为两部分:基本核心启动子和核心上游调节元件(CURS),其上游为负性调节元件(NER,1616-1621 nt).CPD在体内与HBV核心启动子结合的作用还不清楚,我们分别构建HBV核心启动子及羧肽酶N的重组载体,通过脂质体转染NIH 3T3细胞,研究CPN对核心启动子的调节表达.方法:根据HBV核心启动子及羧肽酶N的序列设计引物,在核心启动子的引物两端引入MIu Ⅰ和Nhe Ⅰ的酶切位点,在羧肽酶N的引物两端引入EcoR Ⅰ和BamHⅠ的酶切位点.用聚合酶链反应(PCR)的方法分别扩增HBV核心启动子和羧肽酶N基因,克隆到pGEM-Teasy载体上.核心启动子经MIu Ⅰ和Nhe Ⅰ双酶切回收连接到同样酶切的pCAT载体上,羧肽酶N经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切回收连接到同样酶切的pcDNA3.1(-)质粒上,构建HBV核心启动子的报告载体及羧肽酶N的真核表达载体,脂质体法瞬时转染NIH 3T3细胞.结果:HBV核心启动子和羧肽酶N(CPN)的PCR产物经1%琼脂糖电泳鉴定与预期大小符合,分别为206 bp和580 bp.重组载体经双酶切鉴定后,证明HBV核心启动子的报告载体及羧肽酶N(CPN)的真核表达载体构建成功.脂质体法瞬时转染NIH 3T3细胞48 h后,用ELISA法检测β-gal的表达,显示核心启动子在羧肽酶N(CPN)的影响下,其活性有大约5-6倍的增加.通过体内实验证明羧肽酶N(CPN)可以上调HBV核心启动子的表达.结论:HBV核心启动子结合蛋白羧肽酶N(CPN)与HBV核心启动子共转染细胞,明显调节HBV核心启动子的表达,为进一步研究HBV复制的分子生物学机制提供了新的理论基础.
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原发性肝癌与乙型肝炎病毒基本核心启动子和前C区基因变异的相关性
目的 研究原发性肝癌(PLC)与HBV基本核心启动子(BCP)和前C区基因变异的相关性.方法 对144例HBsAg(+)PLC患者的血清进行HBV标志物和HBV DNA检测,对HBeAg(-)但HBV DNA(+)的样本再采用实时荧光定量PCR进行前C区和BCP区基因变异检测.随机选取120例慢性乙型肝炎(CHB)患者作为对照组.结果 PLC患者血清HBV标志物中HBeAg(+)46例.占31.94%,HBeAg(-)98例,占68.06%.在98例HBeAg(-)患者的血清中,HBV DNA(+)56例,占57.14%,其中前C1896变异43例,占76.79%,BCP1762/1764基因变异50例,占89.29%,共同变异38例,占67.86%.PLC患者中的前C1896和BCP1762/1764基因变异率高于CHB患者,且差异有统计学意义(χ2值分别为9.36和5.77,P值均＜0.05).结论 PLC的发生可能与前C区和BCP区基凶变异有关.
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HBV基本核心启动子区和前C区变异与肝病进展的关系
乙型肝炎病毒( HBV)感染是我国严重的卫生健康问题,目前大约有1.7亿慢性HBV感染者,约占世界慢性HBV感染者的一半[1].HBV基因组结构为部分环状双链DNA,全长约3.2 kb,其核心启动子对于HBV的复制和形态构成发挥了关键性作用.核心启动子包含基本核心启动子区(basal core promoter,BCP)和上游调控区(upper regulatoryregion,URR),直接引导两种3.5 kb mRNA的转录,即前基因组mRNA( pregenomic RNA,pgRNA)和前CmRNA( precore mRNA,pre-C mRNA).BCP区位于基因组中核苷酸1742～1849位置,目前发现的变异主要有A1762T/G1764A双变异,C1653T、T1753C/A/G、C1766T/T1768A变异等,还发现有缺失和插入变异[2-3].A1762T/G1764A双变异是BCP区常见的,也是重要的变异,目前研究较多.
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HBV基本核心启动子和前C区变异的深度测序分析
目的：利用Ion Torrent PGM深度测序技术，探讨乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）阳性慢性乙型肝炎（CHB）患者乙型肝炎病毒（HBV）基本核心启动子和前C区突变特征。方法收集HBeAg阳性CHB患者血清样本25例，提取HBV DNA，采用巢式PCR方法扩增HBV基本核心启动子和前C区片段，构建深度测序文库，基于Ion Torrent PGM平台深度测序，生物信息学分析突变位点及其突变率；构建HBV基本核心启动子和前C区突变型和野生型参考质粒，作为深度测序质控品。结果在25例HBeAg阳性CHB患者HBV基本核心启动子和前C区检出流行率达20%的突变位点10个：G1746A、A1752G/T、T1753C/G、A1762T、G1764A、C1817G/A、T1825C/A、A1846T、G1896A、G1899A；G1746A和T1825C/A的流行率分别达92%和100%。突变位点在HBV B基因型和C基因型感染者的分布情况显示，A1752G/T和G1896A主要流行于B基因型感染者（63.6% vs 0.0%，χ2=12.374、P =0.0007；72.7% vs 28.6%，χ2=4.812、P =0.0472），A1762T和G1764A主要流行于C基因型感染者（27.3% vs 78.6%，χ2=6.579，P =0.0172）；C基因型感染者A1762T/G1764A突变率显著高于B基因型感染者，但差异无统计学意义（25.7%±28.4% vs 68.4%±42.7%，t =1.614、P =0.1326）。25例HBeAg阳性CHB患者中，32.0%患者仅有A1762T/G1764A突变，24.0%患者仅有G1896A突变，24.0%患者同时携带A1762T/G1764A和G1896A突变。结论深度测序分析可用于定量检测HBV基本核心启动子和前C区突变，为HBV突变研究的临床应用提供了技术平台。
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958例乙型肝炎患者HBV前C/BCP区变异检测及其意义分析
目的 检测不同病情乙型肝炎患者HBV前C/BCP区的变异特点并分析变异的意义.方法 采用巢式PCR方法 扩增399例轻中度慢性乙型肝炎、211例重度慢性乙型肝炎和348例慢性重型乙型肝炎患者的HBV前C/BCP区序列,PCR产物纯化后直接测序.分析10个热点变异位点及其插入/缺失变异情况,并进行统计学分析,比较这些变异对病情进展的影响.结果 随着病情的加重,T1753、A1762、G1764、C1766、T1768、G1862、G1896、G1899等8个位点变异频率显著增加(P<0.01),其中5个位点的变异发生率呈现出轻中度慢性乙型肝炎<重度慢性乙型肝炎<慢性重型乙型肝炎的阶梯式上升特点.3组患者未检出突变的比率分别为27.82%、7.58%和2.01%,呈现阶梯式下降特点.此外,前C/BCP区多联变异和插入/缺失突变的发生率在病情加重时也明显增加(P<0.01),其中三联变异率依次为轻中度慢性乙型肝炎35.34%、重度慢性乙型肝炎53.56%、慢性重型乙型肝炎67.82%.结论 乙型肝炎患者HBV前C/BCP区多个位点变异与慢性乙型肝炎的重症化进程相关,对乙型肝炎重症化发生机制的研究及其临床预警分析有积极意义.
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广西肝癌高发区乙型肝炎病毒基本核心启动子区A1762T/G1764A双突变对肝癌家族聚集的影响
目的 探讨广西肝癌高发区乙型肝炎病毒(HBV)基因组基本核心启动子(BCP)区A1762T/G1764A双突变对肝癌家族聚集的影响.方法 收集2007年7月-2012年7月广西肝癌高发区39个肝癌高发家族中103例成员作为试验组,在相同地区59个无癌家族中选择与试验组年龄、性别、生活环境匹配的103例成员作为对照组,将试验组按家族患肝癌例数分为2～3例亚组(45例)和≥4例亚组(58例);按亲属分级分为一级亲属组(48例),二级亲属组(32例),三级及以上亲属组(23例).提取所有研究对象HBV DNA,PCR扩增并测序检测BCP区A1762T/G1764A双突变情况.结果 试验组A1762T/G1764A双突变率高于对照组[x2=12.518,P＜0.001;OR =2.788,95％CI (1.569,4.955)].试验组男性A1762T/G1764A双突变率高于对照组[x2=11.377,P=0.001;OR=3.450,95％CI (1.659,7.176)];两组女性A1762T/G1764A双突变率比较,差异无统计学意义[x2=1.983,P=0.159; OR=1.950,95％CI (0.766,4.965)].试验组≥30岁年龄段A1762T/G1764A双突变率高于对照组[x2=10.743,P=0.001;OR =3.444,95％CI (1.622,7.314)];两组＜30岁年龄段A1762T/G1764A双突变率比较,差异无统计学意义[x2=2.489,P=0.115; OR=2.053,95％CI(0.836,5.041)].试验组患肝癌2～3例亚组与≥4例亚组A1762T/G1764A双突变率比较,差异有统计学意义[(x2=6.639,P=0.01; OR=3.122,95％CI (1.290,7.555)].3组A1762T/G1764A双突变率比较,差异有统计学意义(P＜0.05).一级亲属亚组双突变率高于二级亲属亚组(P＜0.05).试验组HBeAg阴性者突变率高于HBeAg阳性者(x2=6.361,P=0.012).试验组A1762T/G1764A双突变者HBV DNA水平低于无双突变者(Z=-3.957,P＜0.01).结论 广西肝癌高发区HBV BCP区A1762T/G1764A双突变与肝癌家族聚集密切相关,A1762T/G1764A双突变可能对肝癌的发生具有重要的预测价值.
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乙型肝炎病毒基本核心启动子和前C基因序列分析
目的 研究乙型肝炎病毒(HBV)基本核心启动子(BCP)区及前C(Pre C)区基因的变异情况,并且分析其发生频率、分布规律及其与临床病情的关系.方法 应用套式PCR扩增nt1660-1935的HBV DNA片段及PCR产物直接测序的方法检测BCP区及Pre-C区基因的变异情况.结果 130例乙型肝炎患者标本中,BCP区nt1762/nt1764发生双突变者75例(57.69%),Pre-C区nt1896发生突变者20例(15.38%),并且这两种突变在重型肝炎组(75.00%)及肝硬化组(72.22%)所占比例均明显高于慢性肝炎组(52.56%);此外,在BCP区及Pre-C/C区还发现了一些突变频率较高的其他突变位点(如nt1753,nt1766,nt1846,nt1899,nt1915),其中nt1753突变仅发生于有nt1762/1764双突变的患者,与重型肝炎及肝硬化的发生有一定关系;在BCP区有4处核苷酸突变共存者10例,其中重型肝炎组(12.50%)及肝硬化组(13.88%)所占比例明显高于慢性肝炎组(5.12%).结论 HBV BCP区nt1762/nt1764双突变和Pre-C区nt1896突变与肝炎的活动、重型化及肝硬化的发生有关;BCP区其他位点的突变共存对肝炎病情的进展也有重要影响.
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C型乙型肝炎病毒的全基因组序列分析
目的探索乙型肝炎病毒(HBV)全基因组的结构特点.方法应用直接PCR基因分型法确定HBV基因型,然后随机选择1例单纯HBV C基因型感染的患者血清,分3个相互重叠片段扩增HBV基因并分别克隆测序.利用Vector NTI Suite 7.0软件包、GeneDoc 2.6和TreeView 1.5,将该3个基因片段拼接为全基因组序列,命名为BDHB1,并进行基因进化树分析和同源性比较.结果 HBV C基因型序列全长为3215 bp,其中A占22.2%,G占22.4%,C占26.8%,T占28.6%;有S、C、P和X区4个开放读码框架(ORFs);HBsAg亚型为adr;HBVRT区549～552aa为YMDD,未发生变异;未发现前C区nt1896G变异:BCP区nt1762、1764发生双突变.对HBV分段序列及全基因组序列进行基因进化树分析显示,BDHB1与HBVVC基因型的同源性高.结论 BDHB1基因组符合HBV C基因型结构特点,在BCP区存在双突变.分片段扩增再拼接可作为全基因组序列分析方法之一.
关键词： 乙型肝炎病毒(HBV) 基因型 基本核心启动子 变异 -
HBV基因型、基本核心启动子区双突变和肝细胞癌发生及临床病理特征的关系
目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)基因型、基本核心启动子(BCP)区双突变(简称BCP双突变)和肝硬化(LC)、肝细胞癌(HCC)发生的关联,分析BCP双突变和HCC临床病理特征的关系.方法 随机收集233例慢性HBV感染者的血清,其中80例为慢性乙型肝炎(CHB)患者、75例为LC患者、78例为HCC患者,并系统整理患者的常规检查和病理等资料.采用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测BCP双突,用特异性引物多重PCR扩增确定HBV基因型.用SPSS 11.0分析结果.结果 HBV基因型结果均为B和C型,分别在CHB和LC组,CHB和HCC组间分布差异有统计学意义(P＜0.05),在LC和HCC组间分布差异无统计学意义(P＞0.05),感染C基因型与LC和HCC发生相关(分别OR=2.73,95％ CI=1.29 ～5.82;OR =2.00,95％ CI =0.98 ～4.09).BCP双突变也分别在CHB和LC组,CHB和HCC组间分布差异有统计学意义(P＜0.05),在LC和HCC组间分布差异无统计学意义(P＞0.05),双突变与LC和HCC发生相关(分别OR=1.91,95％CI=0.96 ～3.82；OR =2.05,95％CI=1.04 ～4.06).BCP双突变和伴肝硬化的HCC相关(P＜0.05).结论 感染HBV C基因型、BCP双突变可能均是LC和HCC发生的危险因素,BCP双突变可作为LC和HCC早期预警生物标记物.
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反向斑点杂交法检测HBV基本核心启动子区A1762T/G1764A突变的实验研究
目的 建立一种基于尼龙膜的反向斑点杂交法,用于检测乙型肝炎病毒(HBV)基本核心启动子区(BCP)A1762T/G1764A突变.方法 根据我国HBV主要流行的基因型为B和C,从GenBank上查出4种HBV BCP序列.利用在线工具Clustal W进行比对,针对该突变位点设计引物和检测探针.探针经合成和修饰后点在带正电的尼龙膜上.将反向斑点杂交法结合地高辛检测试剂盒用于检测A1762T/G1764A突变,以测序法确定该区域序列的标本为检测对象.结果 反向斑点杂交法分别检测5例A 1762/G1 764病毒株、2例T1762/G1764病毒株、5例A1762/A1764病毒株和4例T1762/A1764病毒株,结果与测序完全相同.结论 应用本方法可以快速、准确地HBV相关的热点突变.
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重视HBeAg阴性慢性乙型肝炎的诊断和治疗
早在20多年前,国外学者就关注到HBeAg阴性慢性乙型肝炎的问题.并随后发现HBV前C区和基本核心启动子(BCP)的变异与产生HBeAg阴性变异株乙型肝炎病毒有关.HBeAg阴性慢性乙型肝炎全球均有分布,但主要分布在地中海地区国家,占慢性乙型肝炎的50%以上.
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儿童乙型肝炎病毒基本核心启动子变异的检测及其意义
目的探讨儿童慢性乙肝病毒基本核心启动子(BCP)基因双变异(nt1762A→T和nt1764G→A)的临床特征和意义.方法采集空腹肘静脉血,分离血清备检;以金标层析方法检测乙肝病毒(HBV)免疫标志物,以微板核酸探针杂交技术检测HBV BCP区双位点变异及其DNA定性;将研究对象分为轻、中、重3组,分别统计各组BCP双变异阳性率,分析BCP区双变异与血清HBeAg的相关性.结果慢性乙肝患儿HBV DNA检测阳性率82.98%(78/94),HBeAg阳性组显著高于阴性组(P<0.001);BCP区双变异阳性率为15.96%(15/94),HBeAg阳性组明显低于阴性组(χ2=5.36,P<0.05);轻、中、重3组HBV BCP变异率分别为4.44%、13.79%和45.00%,中、重两组比较差异有显著性(χ2=5.91,P<0.05).结论儿童慢性乙肝病毒BCP双变异检出率血清HBeAg阴性组明显高于HBeAg阳性组,此处双变异减少了但未完全终止HBeAg的产生;儿童慢性乙肝HBV BCP双变异发生率与病变程度呈正相关,检测BCP区双变异对病情预后的判断有一定参考价值.
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乙型肝炎病毒前C区和BCP区突变及基因型对HBeAg表达的影响
研究乙型肝炎病毒前C区和BCP区突变及基因型对HBeAg表达的影响.分别用基因芯片和基因测序的方法检验HBV DNA阳性的乙型肝炎病毒前C区和BCP区突变及基因型,应用时间分辨免疫荧光法检测HBeAg含量,按照有无HBV前C区1896、BCP区1762、1764双突变、基因型等指标进行分组分析.无前C区1896和BCP区1762/1764双突变组、单纯1762、1764双突变和1896突变组以及1896、1762、1764联合突变组之间相互比较,HBeAg含量相差显著,F=6.47,P＜0.01;B、C基因型间HBeAg含量相比,相差无显著性,t=0.1394,P＞0.05.乙型肝炎病毒前C区和BCP区突变能显著影响HBeAg量的表达,从而导致乙型肝炎病毒致病能力的变化.
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乙型肝炎病毒前C/BCP区变异的研究现状
HBV的前C区及基本核心启动子(BCP)变异可降低HBeAg的合成与分泌,也可增加病毒复制能力,导致HBeAg阴性慢性乙型肝炎(CHB),对临床产生重要的影响.本文就HBV前C/BCP区变异的分子机理、生物学意义、实验室检测以及对临床和抗病毒治疗的影响等方面的研究进展作一综述.
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HBeAg阴性血清中乙型肝炎病毒基本核心启动子和前C区变异研究
目的 了解本地区乙型肝炎病毒(HBV)流行株基本核心启动子(BCP)和前C(PreC)基因的变异热点,为临床提供诊疗信息.方法 通过设计3条特异性引物进行半巢式聚合酶链反应(PCR)扩增患者血清中HBV BCP和PreC基因序列,回收和纯化PCR产物,用引物P1、P2直接进行正反测序,然后进行比对分析.结果 BCP变异主要集中在TATA样盒(TATA-like box)中的TA1、TA2、TA3区,而TA4极为保守,TA1-TA4未见插入或缺失突变,PreC变异主要集中在nt1896位G→A.另外,发现1例新奇的插入突变.结论 BCP和PreC变异可使HBeAg阴转.
