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慢性HBV感染不同阶段肝组织HBV cccDNA含量与IL-10、IFN-γ的相关性研究
目前尚无特效药能够治愈慢性乙型肝炎,主要原因是HBV cccDNA的存在,HBV cccDNA是HBV前基因组RNA复制的原始模板,可稳定地存在于肝细胞核中.只有宿主的免疫系统能够清除HBV cccDNA.
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外周血DNA提取方法的比较
快速、经济地从外周血或组织中提取高产量、高纯度的DNA,对于疾病的分子水平研究非常重要.目前基因组DNA的提取方法较多,如酚/氯仿、尿素提取法、氯化锌法[1]、三乙醇月桂基硫酸盐(TLS)法、碘化物法[2]、直接煮沸法等等,但也都有其不足之处.通过长期试验,我们建立了一种采用氯化钠高盐沉淀法提取外周血基因组DNA的方法,并与其他几种方法做了比较研究.
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肝细胞因子3和乙型肝炎的调节关系
0 引言乙肝病毒(HBV)是很小的包膜病毒,基因组结构精密,仅约3 200个碱基(bp),但能以小容量发挥高效功能.HBV DNA复制周期开始于共价闭合环状DNA(cccDNA),先转录为前基因组RNA,然后反转录为负链DNA,再合成正链DNA,双链DNA又成熟为cccDNA,是一个连续的过程.分散在整个HBV基因组中有多个调节元件,与细胞或病毒产生的调节因子结合,增强或抑制不同基因的表达[1-3].肝细胞因子3(HNF3)是重要的转录调节因子,对于调节前基因组RNA和前核心RNA等的转录复制有重要的作用.
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乙型肝炎病毒增强子的结构和调控研究
0引言HBV属嗜肝DNA病毒,其基因组为3.2kb部分双链的环状DNA.他的复制需要一个RNA中间物-前基因组RNA,经过反转录产生新的DNA分子.HBV基因组的功能单位十分密集,高度压缩,重复利用.目前已确定有四个主要的开放阅读框架,分别负责编码核心抗原(pre-C/C)、核酸聚合酶(P)、表面抗原(preS/S)和X蛋白(X).这些基因的表达受到顺式元件-启动子和增强子的调控.目前在HBV基因组已发现并鉴定的顺式元件有四个启动子(C、X、SP Ⅰ、SPⅡ)、两个增强子(Enh Ⅰ和EnhⅡ)和糖皮质激素应答元件[1-4].其中增强子的作用主要是调控HBV的转录和复制.
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准种是乙型肝炎病毒存在的基本方式
0引言与其他的慢性病毒一样,乙型肝炎病毒(HBV)与人类长期共存,导致了彼此之间的相互适应.针对HBV来讲,为了生存,就得不断进行适应生存环境的变化.这种变化的内因是HBV DNA聚合酶不仅是DNA聚合酶,而且还是前基因组RNA逆转录为子代DNA的逆转录酶.
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羧肽酶N调节乙型肝炎病毒核心启动子表达活性的研究
目的:乙型肝炎病毒(HBV)的感染,不仅引起急、慢性病毒性肝炎,而且与肝纤维化、肝细胞癌的发生发展密切相关.为深入研究HBV调节表达的机制,我们应用噬菌体展示技术,以HBV核心启动子DNA片段为固相支持物,筛选肝细胞cDNA文库,获得HBV核心启动子的肝细胞结合蛋白-羧肽酶N(CPN).CPN是一种从多肽和蛋白质C端氨基酸残基分离的血浆金属蛋白酶,他在调节激肽和过敏毒素的生物活性上起关键作用.CPN是分子量280 kD的四聚体,包含两个50KD酶性亚单位和两个83 kD调节亚单位.核心启动子产生两个3.5kb RNA:前-核心和前基因组RNA.前-核心RNA编码前-核心蛋白和e抗原,前基因组RNA不仅作为mRNA编码核心蛋白和聚合酶蛋白,而且与病毒蛋白一起包埋入核衣壳,作为模板逆转录.前基因组RNA的表达调控在病毒复制周期中起着关键作用.核心启动子分为两部分:基本核心启动子和核心上游调节元件(CURS),其上游为负性调节元件(NER,1616-1621 nt).CPD在体内与HBV核心启动子结合的作用还不清楚,我们分别构建HBV核心启动子及羧肽酶N的重组载体,通过脂质体转染NIH 3T3细胞,研究CPN对核心启动子的调节表达.方法:根据HBV核心启动子及羧肽酶N的序列设计引物,在核心启动子的引物两端引入MIu Ⅰ和Nhe Ⅰ的酶切位点,在羧肽酶N的引物两端引入EcoR Ⅰ和BamHⅠ的酶切位点.用聚合酶链反应(PCR)的方法分别扩增HBV核心启动子和羧肽酶N基因,克隆到pGEM-Teasy载体上.核心启动子经MIu Ⅰ和Nhe Ⅰ双酶切回收连接到同样酶切的pCAT载体上,羧肽酶N经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切回收连接到同样酶切的pcDNA3.1(-)质粒上,构建HBV核心启动子的报告载体及羧肽酶N的真核表达载体,脂质体法瞬时转染NIH 3T3细胞.结果:HBV核心启动子和羧肽酶N(CPN)的PCR产物经1%琼脂糖电泳鉴定与预期大小符合,分别为206 bp和580 bp.重组载体经双酶切鉴定后,证明HBV核心启动子的报告载体及羧肽酶N(CPN)的真核表达载体构建成功.脂质体法瞬时转染NIH 3T3细胞48 h后,用ELISA法检测β-gal的表达,显示核心启动子在羧肽酶N(CPN)的影响下,其活性有大约5-6倍的增加.通过体内实验证明羧肽酶N(CPN)可以上调HBV核心启动子的表达.结论:HBV核心启动子结合蛋白羧肽酶N(CPN)与HBV核心启动子共转染细胞,明显调节HBV核心启动子的表达,为进一步研究HBV复制的分子生物学机制提供了新的理论基础.
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实时荧光定量PCR检测HBVcccDNA临床应用研究
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)属嗜肝脱氧核糖核酸科(hepadnaviridae),不完全双链DNA病毒,是引起急慢性肝炎的主要病原之一.乙型肝炎病毒与其他DNA病毒相比,不同之处在于它特殊的反转录复制形式,以及特殊的复制中间体共价闭合环DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)的存在.cccDNA是病毒mRNA和前基因组RNA的转录模板,cccDNA的存在是病毒复制的一个重要标志,是病毒感染得以维持的根源,抑制或清除cccDNA是治疗慢性乙型肝炎的关键.
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乙肝病毒共价闭合环状DNA检测可作为评价抗病毒治疗的新指标
第二军医大学附属长征医院的缪晓辉教授在2005年5月召开的中华医学会第十二次全国病毒性肝炎及肝病学术会议上指出,共价闭合环状DNA(cccDNA)是乙肝病毒前基因组RNA复制的原始模板,虽然其含量较少,每个肝细胞内只有约5~50个拷贝,但对乙肝病毒的复制以及感染状态的建立具有十分重要的意义,只有清除了细胞核内的cccDNA,才能彻底消除乙肝患者病毒携带状态,是抗病毒治疗的目标.检测乙肝病毒cccDNA的临床意义包括以下3点.
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慢乙肝患者HBsAg定量与HBV DNA和HBV cccDNA含量的相关性分析
血清中的乙肝病毒脱氧核糖核酸( HBV DNA)是乙肝病毒(HBV)感染直接的证据,检测其阳性提示HBV复制和有传染性;而肝细胞核内的HBV共价闭合环状DNA( HBV cccDNA)则是HBV前基因组RNA复制的原始模板,只有清除了肝细胞核内的HBV cccDNA,才能彻底消除乙肝患者病毒携带状态.然而血清HBV DNA和肝组织HBV cccDNA检测价格昂贵、操作繁琐,不适宜普遍开展;近年来有研究表明,血清HBsAg定量与血清HBV DNA和肝组织HBVcccDNA含量有一定的相关性,可用于临床诊断与治疗检测[1,2].本文就其相关性进行初步研究,旨在将血清HBsAg含量指标应用于HBV复制状态和临床治疗效果的评价中.
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乙型肝炎HBeAg与HBV DNA定量关系的探讨
目前HBV DNA和HBeAg的存在及其水平是反映HBV感染及传染性强弱的直接可靠的指标,是临床上指导慢性乙型肝炎的诊断、治疗及预测疗效的重要依据.随着分子生物学技术,荧光免疫技术的发展,HBV脱氧核糖核酸及其血清标志物检测已由过去的定性检测发展到现在的定量检测.近年来关于HBeAg与HBV DNA定量关系的研究越来越多,在此,我们就HBeAg与HBV DNA的定量关系进行分析与探讨.一、HBV DNA与HBeAg的形成过程HBV DNA的复制分成两个阶段:第一阶段,在肝细胞核内,部分双链环状HBV DNA(rcDNA)进入肝细胞核后,在宿主酶的作用下,以负链DNA为模板延长正链,形成共价闭合环状DNA(cccDNA),然后以cccDNA为模板,在宿主RNA聚合酶Ⅱ的作用下,转录成几种不同长短的mRNA,其中3.5 kb的mRNA含有HBV DNA序列上全部遗传信息,称为前基因组RNA(pgRNA);第二阶段,在肝细胞质中,pgRNA被转运至肝细胞质,pgRNA和DNA聚合酶一起被核壳蛋白(HBcAg)包裹形成病毒核心,在核心颗粒内,pgRNA作为模板,在DNA聚合酶介导下,合成负链DNA;再以负链DNA为模板,合成正链DNA,形成子代的rcDNA,胞质中的子代rcDNA也可进入肝细胞核内,再形成cccDNA,维持cceDNA池并继续复制.另外一部分mRNA转译病毒蛋白:HBcAg、HBeAg、HBsAg、P蛋白、X蛋白[1].
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乙型肝炎病毒感染患者血清cccDNA检测及其临床应用
在感染乙型肝炎病毒(HBV)的肝细胞核内可检测到一种不同形式的病毒共价闭合环状DNA(cccDNA),不与蛋白共价结合.cccDNA是嗜肝DNA病毒科病毒基因组的复制中间体,是嗜肝DNA病毒mRNA和前基因组RNA的合成模板,是嗜肝病毒持续感染的关键因素[1-2].目前普遍使用的慢性乙型肝炎抗病毒治疗能很好的抑制HBV复制,控制病情,但是一旦停药后HBV很容易再次复制,其原因就在于肝细胞中HBVcccDNA的持续存在,因此,清除HBVcccDNA是真正治愈乙肝的关键,HBV cccDNA的相关研究是医学界的重点和热点之一.HBV cccDNA主要位于感染的肝细胞核中,一般使用肝脏组织来检测.但是肝组织样本采集困难,限制了其使用.近年,有研究检测血清中HBVcccDNA载量,并探讨其在临床中的运用.
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乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA
HBV共价闭合环状脱氧核糖核酸(cccDNA)是嗜肝 DNA病毒基因组的复制中间体,是嗜肝 DNA 病毒部分基因的mRNA和前基因组 RNA的合成模板,在 HBV感染初期即能检测到,且长期存在于细胞核中。其在 HBV 复制过程中起着关键的作用,它的长期存在也是乙型病毒性肝炎慢性化的主要原因之一。HBV cccDNA肝细胞中持续感染及抗病毒治疗复发之间的关系受到广泛的关注与肯定,现就 HBV cccDNA 常用检测方法及其临床意义作一综述。
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HBV感染者外周血白细胞中HBVcccDNA检测的临床价值
在HBV感染的肝细胞核内可检测到一种不同形式的病毒DNA--共价闭合环状DNA(HBVcccDNA),不与蛋白共价结合,是乙肝病毒基因组的复制中间体,是病毒mRNA和前基因组RNA转录的模板,它的存在是病毒复制的一个重要指标,也是评价HBV感染状态及药物疗效重要的指标,但取材困难.
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乙型肝炎病毒前基因组启动子的调节机制
乙型肝炎病毒(HBV)是一种DNA病毒,但其基因组的复制是通过DNA-RNA-DNA的途径来实现的.作为从RNA逆转录为前基因组DNA的模板,3.5千的RNA的转录非常重要.目前的研究证实,前基因组启动子和核心启动子(CP)是2段位置相近,但结构与调节机制又不相同的启动子,虽然均指导3.5千核苷酸的RNA转录,但作为前基因组和翻译模板的RNA,其5'末端序列不同.前基因组启动子序列活性受到一系列不同的蛋白质因子的调节,增强子对于HBV前基因组启动子的活性也有重要的调节作用.
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HBV cccDNA检测技术进展
乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(hepatitis B virus covalently closed circular DNA, HBVcccDNA)是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)复制的中间体,是HBV mRNA和前基因组RNA合成的模板[1~2].在HBV生活周期中, HBV cccDNA的形成是关键的一步,是HBV持续感染的关键因素,也是指导乙肝抗病毒治疗的重要依据[3~4].Southern blot是检测HBV cccDNA的经典方法[5~6],但其检测过程复杂,技术要求高,操作可控性差,且灵敏度不高.
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乙型肝炎病毒的相关检验指标研究进展
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)属正嗜肝DNA病毒,其基因组DNA为松弛环状DNA(relayed circular DNA,rcDNA),进入肝细胞核后转换为共价闭合环状DNA(covalenly closed circular DNA,cccDNA).HBV cccDNA是信使RNA(messenger RNA,mRNA)和前基因组RNA(pregenome RNA,pgRNA)合成的模板,在整个自然病程中持续存在[1].人们被HVB感染引起的乙型肝炎(简称乙肝)是发病率高的传染病之一.目前经过献血员筛查和疫苗接种等预防措施在一定程度上能够降低乙肝发病率,但现在全世界仍有3亿HBV感染者.