首页 > 文献资料
-
香烟烟气提取物对NR8383细胞吞噬功能的影响
目的 探讨不同浓度香烟烟气提取物(CSE)对大鼠肺泡巨噬细胞(NR8383)吞噬功能的影响.方法 通过CCK-8法分析细胞比活力,Annexin-V FITC/PI双染法检测细胞凋亡以及CFSE荧光标记分析细胞的分裂增殖,来确定CSE对NR8383细胞的作用浓度和作用时间.收集经不同浓度CSE处理24 h的NR8383细胞,与FITC标记的大肠杆菌共同孵育2 h后,用流式细胞仪检测胞内荧光强度,分析CSE对细胞吞噬功能的影响.结果 NR8383细胞的吞噬功能随着CSE浓度的变化先增强后降低.单独用CSE处理NR8383细胞,在100μg/ml CSE作用下,巨噬细胞的吞噬功能与正常对照组相比提高0.5倍,此时的细胞比活力高.在CSE和LPS共同作用下,CSE的浓度为100μg/ml时,NR8383细胞的吞噬功能提高到正常水平的3倍.而当CSE浓度达到200μg/ml时,NR8383细胞的吞噬功能受到损伤,细胞凋亡率为54.1%.结论 CSE可以影响NR8383细胞的吞噬功能,在较低浓度时可能激活巨噬细胞的吞噬功能,但较高浓度时可能对巨噬细胞的吞噬功能造成损伤,CSE可能具有激活巨噬细胞吞噬功能的潜能.
-
PI3KC3/Beclin1复合物对染矽尘NR8383细胞自噬的调控作用
[目的]探讨PI3KC3/Beclin1复合物在染矽尘大鼠肺泡巨噬细胞(NR8383)自噬中的调控作用.[方法]常规培养NR8383细胞,随机分为4组:对照组,矽尘组,3-MA组和3-MA干预组,分别孵育1、3、6、12、20h后收集样品.采用蛋白免疫印迹方法检测自噬标记蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)、自噬底物蛋白p62以及自噬相关蛋白Beclin1、PI3KC3;采用激光扫描共聚焦显微镜观察孵育不同时间的自噬免疫荧光表达情况;采用免疫共沉淀检测Beclin1复合物表达.[结果]免疫荧光结果显示,矽尘组LC3点状聚集绿色荧光亮斑随时间先增强后减弱,在6h时荧光强,且各时间点较对照组和3-MA干预组荧光亮斑增强;3-MA干预组LC3荧光标记绿色亮斑先增强后减弱,弱于矽尘组,但强于对照组.加入溶酶体抑制剂二磷酸氯喹后,各组LC3绿色荧光信号随时间均呈现增强的趋势.Western blot结果显示,矽尘组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值呈先增加后减少趋势,且在各个时间点均高于对照组(P＜0.05);在LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值达高的6h时间点,矽尘组的值是对照组的248％,是3-MA组的372％.3-MA干预组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值也呈先增加后减少趋势;除1h时间点外,余各时间点均低于矽尘组,但高于对照组(P＜0.05);在LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值达高的6h时间点,3-MA干预组的值是矽尘组的90％,是对照组的223％.Beclin1、PI3KC3蛋白表达趋势与LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值一致,p62蛋白表达趋势与LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值相反.免疫共沉淀显示,矽尘组Beclin1与PI3K结合增加,3-MA干预后两者结合减少.[结论]矽尘诱导NR8383细胞的自噬活动随时间发生不同程度的改变,3-MA可下调矽尘诱导的NR8383细胞自噬活动,推测PI3KC3/Beclin1信号通路参与矽尘诱导肺泡巨噬细胞的自噬过程.
-
miR-144负性调节大鼠巨噬细胞TOLL样受体2的表达
目的：明确TOLL样受体2（TLR2）与microRNA144（miR-144）作用之间的关系。方法利用不同浓度的miR-144的模拟物（mimics）和抑制剂（inhibitor）瞬时转染大鼠巨噬细胞系NR8383细胞，RT-qPCR检测miR-144和TLR2及其下游分子TNF-α的表达。利用大鼠肝脏cDNA为模板，PCR获取目的片段（即含miR-144野生及突变结合位点的TLR2 mRNA的3'UTR区）；用SacⅠ、XbaⅠ双酶切pmirGLO报告基因载体和含miR-144野生及突变结合位点的TLR2 mRNA的3'UTR区，构建携带上述片段的双荧光素酶报告基因，并通过PCR、双酶切、DNA测序鉴定构建的重组质粒，即pmir-TLR2-3'UTR及pmir-mutant-TLR2-3'UTR；并用miR-144的mimics与双荧光素酶报告基因共转染明确miR-144与TLR2 mRNA的3'UTR区的靶向关系。结果瞬时转染100 nmol/L miR-144 mimics后，NR8383细胞中miR-144表达显著升高，而TLR2及其下游分子TNF-α表达显著下降；而100 nmol/L miR-144 inhibitor作用则相反。PCR和双酶切DNA测序结果证实pmir-TLR2-3'UTR及pmir-mutant-TLR2-3'UTR重组载体构建成功；用100 nmol/L miR-144 mimics与空载体及上述两个构建体分别共转染HEK 293T细胞后，pmir-TLR2-3'UTR转染组相对荧光素酶活性显著降低。结论 miR-144通过靶向结合TLR2 mRNA的3'UTR区负性调节TLR2及其下游促炎因子的表达。
-
SiO2粉尘刺激对NR8383细胞分泌炎症因子的影响
目的:比较不同剂量SiO2粉尘刺激NR8383细胞后TNF-α,IL-1β,TGF-β基因表达水平变化.方法:细胞接受不同剂量粉尘刺激后,采用MTT法检测各组细胞活力的改变,筛选出细胞存活率比较高的剂量.细胞随机分为四组,即对照组,10 μg/cm2组、20 μg/cm2组和40 μg/cm2组,接受粉尘刺激12h后,采用荧光定量PCR法测定各组TNF-α,IL-1β,TGF-β基因表达水平.结果:随着染尘剂量的提高,细胞存活率逐渐降低,80 μg/cm2组细胞存活率低.实时荧光定量PCR显示10 μg/cm2组、20 μg/cm2组和40 μg/cm2组TNF-α,IL-1β,TGF-β基因表达水平均高于对照组,差异具有统计学意义(P＜0.05).随着染尘剂量的递增,TNF-α,IL-1β,TGF-β的mRNA相对表达水平逐渐增高.结论:粉尘刺激可以引起大鼠肺泡巨噬细胞分泌炎症因子增加,呈现一定的剂量效应关系.
