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PI3KC3/Beclin1复合物对染矽尘NR8383细胞自噬的调控作用
[目的]探讨PI3KC3/Beclin1复合物在染矽尘大鼠肺泡巨噬细胞(NR8383)自噬中的调控作用.[方法]常规培养NR8383细胞,随机分为4组:对照组,矽尘组,3-MA组和3-MA干预组,分别孵育1、3、6、12、20h后收集样品.采用蛋白免疫印迹方法检测自噬标记蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)、自噬底物蛋白p62以及自噬相关蛋白Beclin1、PI3KC3;采用激光扫描共聚焦显微镜观察孵育不同时间的自噬免疫荧光表达情况;采用免疫共沉淀检测Beclin1复合物表达.[结果]免疫荧光结果显示,矽尘组LC3点状聚集绿色荧光亮斑随时间先增强后减弱,在6h时荧光强,且各时间点较对照组和3-MA干预组荧光亮斑增强;3-MA干预组LC3荧光标记绿色亮斑先增强后减弱,弱于矽尘组,但强于对照组.加入溶酶体抑制剂二磷酸氯喹后,各组LC3绿色荧光信号随时间均呈现增强的趋势.Western blot结果显示,矽尘组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值呈先增加后减少趋势,且在各个时间点均高于对照组(P＜0.05);在LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值达高的6h时间点,矽尘组的值是对照组的248％,是3-MA组的372％.3-MA干预组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值也呈先增加后减少趋势;除1h时间点外,余各时间点均低于矽尘组,但高于对照组(P＜0.05);在LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值达高的6h时间点,3-MA干预组的值是矽尘组的90％,是对照组的223％.Beclin1、PI3KC3蛋白表达趋势与LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值一致,p62蛋白表达趋势与LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值相反.免疫共沉淀显示,矽尘组Beclin1与PI3K结合增加,3-MA干预后两者结合减少.[结论]矽尘诱导NR8383细胞的自噬活动随时间发生不同程度的改变,3-MA可下调矽尘诱导的NR8383细胞自噬活动,推测PI3KC3/Beclin1信号通路参与矽尘诱导肺泡巨噬细胞的自噬过程.
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白藜芦醇对胃癌 SGC7901细胞自噬的影响及其机制探讨
目的：观察白藜芦醇（ RES）对胃癌SGC7901细胞自噬的影响，探讨Ⅲ型PI3 K激酶在其中的作用。方法不同浓度（0、10、20、50、75、100μmol/L） RES作用SGC7901细胞24 h，或Ⅲ型PI3K特异性抑制剂6-氨基-3-甲基嘌呤（3-MA）、渥曼青霉素（WM）及自噬晚期抑制剂氯喹（CQ）预处理细胞1 h后加入不同浓度RES再作用24 h；采用Western blot法观察自噬特异性蛋白LC3由Ⅰ型向Ⅱ型转化的情况，甲丹磺酰尸胺染色（ MDC）观察自噬囊泡。结果不同浓度RES均可引起LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转化，且随浓度增加转化越明显；CQ预处理1 h后RES继续处理24 h，细胞内LC3蛋白转化、自噬酸性囊泡进一步增加；Ⅲ型PI3K特异性抑制剂3-MA（WM）不改变RES引起的LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转化，不抑制MDC阳性细胞增加、细胞内酸性囊泡的聚集。结论 RES可增强胃癌SGC7901细胞内自噬水平，而非自噬降解功能削弱导致，该作用不依赖于Ⅲ型PI3K。
