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半巢式PCR法在鉴定风疹病毒标本基因型中的应用
目的在无法成功分离风疹病毒的前提下鉴定风疹病毒阳性标本的基因型,从而全面完整地了解河北省风疹病毒基因型的特征.方法采用半巢式PCR法,将盲传三代风疹病毒核酸检测为阴性而咽拭子标本风疹病毒核酸检测为阳性的风疹疑似病例咽拭子标本进行核酸扩增、序列测定和分析.结果检测的11份风疹疑似病例咽拭子标本中有6份为2B基因型风疹病毒,5份为1E基因型风疹病毒,11份标本与相应的各基因型参考株同源性高,重要抗原位点未发生变异.结论使用半巢式PCR法能够成功地鉴定出盲传为阴性的风疹病毒基因型,丰富了风疹病毒基因库,并为更全面地了解河北省风疹病毒分子流行病学提供依据.
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猪博卡病毒环状附加体的发现与鉴定
为了证实博卡病毒可以环状附加体形式存在于宿主体内,本研究利用半巢式PCR方法在健康猪粪便标本中筛查出2株猪博卡病毒环状附加体PBoV_G2-episome和PBoV_G3-episome.通过反复测序和序列拼接得到其末端非编码区序列(405nt和511nt).经过对其进行序列分析及二级结构的预测,发现PBoV_G2-episome与人博卡病毒3附加体(HBoV3-episome)结构相似,而PBoV_G3-episome与博卡病毒属其他成员的末端二级结构存在较大差别.猪博卡病毒环状附加体的发现证实了有些博卡病毒与其他细小病毒的复制方式存在一定差异,也为今后博卡病毒感染性克隆的构建提供了一条研究思路.
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中东呼吸综合征冠状病毒半巢式PCR检测方法的建立
目的 建立特异、灵敏的半巢式PCR方法以期用于检测中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV). 方法 根据MERS-CoV N蛋白基因设计并合成特异性内侧、外侧引物.通过条件优化,建立MERS-CoV半巢式PCR检测体系,扩增产物测序后与目的序列进行同源比对.以10倍系列稀释重组质粒为标准品,与普通PCR反应进行比较,检测半巢式PCR方法的灵敏度.以其他6种呼吸道病原体及冠状病毒基因为对照,检测半巢式PCR方法的特异性. 结果 使用建立的半巢式PCR方法扩增的特异片段与GenBank中发表的MERS-CoV基因序列同源性为100％;半巢式PCR检测方法的灵敏度为1.17×101拷贝,比普通一轮PCR扩增的灵敏度(1.17×10 5拷贝)提高了104倍;用该方法检测MERS-CoV基因为阳性,其他6种呼吸道病原体及冠状病毒基因检测均呈阴性. 结论 建立的MERS-CoV半巢式PCR方法具有良好的准确性、灵敏性和特异性,为MERS-CoV感染的诊断提供了一种新的、可靠的检测手段.
关键词： 中东呼吸综合征冠状病毒 半巢式PCR 检测方法 敏感 特异 -
应用半巢式PCR检测我国北方一些蜱种中的查菲埃立克体
目的:了解我国北方一些蜱种中是否携带查菲埃立克体(Ehrlichia chaffeensis,简写为EC).方法:应用半巢式PCR检测蜱的带菌率, 利用16S rRNA基因测序方法鉴定所测序列.结果:从内蒙古莫尔道嘎林业局采集的全沟硬蜱和森林革蜱中扩增出查菲埃立克体的16S rRNA基因,阳性率分别是39.06%和10.00%;并从新疆精河采集的全沟硬蜱和草原革蜱中也测到相同的序列,小阳性率分别为5.79%和1.67%.对莫尔道嘎采集的蜱标本进行1 220bp的EC16S rRNA基因分析,结果与美国1株查菲埃立克体 (GenBank U23503) 的相应序列只差1个碱基.结论:所使用的两套半巢式PCR扩增引物,可以简便快速地检测和分析蜱标本中可能存在的EC.
关键词： 半巢式PCR 查菲埃立克体 蜱 16S rRNA基因 -
半巢式PCR检测FOXC2基因多态性实验条件研究
目的:研究半巢式PCR方法检测FOXC2基因5'非翻译区C-512T多态性的实验条件.方法:对实验研究中的主要影响因素设置各系列浓度和梯度,进行PCR反应后观察电泳结果,选取适条件.结果:适温度为58℃,适Mg2+浓度为3.0mmol/L,适dNTP浓度为2.5mmol/L.适扩增循环为第一次扩增35个循环,第二次扩增30个循环.结论:摸索适实验条件是进行批量实验的前提和关键.
关键词： 半巢式PCR FOXC2基因多态性 实验条件 -
HBeAg阴性血清中乙型肝炎病毒基本核心启动子和前C区变异研究
目的 了解本地区乙型肝炎病毒(HBV)流行株基本核心启动子(BCP)和前C(PreC)基因的变异热点,为临床提供诊疗信息.方法 通过设计3条特异性引物进行半巢式聚合酶链反应(PCR)扩增患者血清中HBV BCP和PreC基因序列,回收和纯化PCR产物,用引物P1、P2直接进行正反测序,然后进行比对分析.结果 BCP变异主要集中在TATA样盒(TATA-like box)中的TA1、TA2、TA3区,而TA4极为保守,TA1-TA4未见插入或缺失突变,PreC变异主要集中在nt1896位G→A.另外,发现1例新奇的插入突变.结论 BCP和PreC变异可使HBeAg阴转.
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半巢式PCR和PCR-RFLP法诊断耐青霉素肺炎链球菌的比较
目的 评价半巢式PCR和PCR-RFLP法用于诊断肺炎链球菌青霉素耐药性的价值.方法 收集130株肺炎链球菌临床分离株和50株健康人定植株,琼脂稀释法测定青霉素低抑菌浓度(MIC),半巢式PCR、PCR-RFLP法测定对青霉素耐药性.结果 健康人定植株均对青霉素敏感,临床分离株青霉素敏感率、中介率、耐药率分别为25.4%、23.1%和51.5%;当MIC为0.25～0.5μg/ml时,半巢式PCR法检测青霉素耐药性的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为86.7%、98.6%、86.7%和98.6%;当MIC≥1μg/ml时,对应值分别为96.2%、97.6%、97.4%和96.4%.而PCR-RFLP法诊断中介株的敏感性仅34.2%;诊断耐药株的阳性预测值仅67.5%.结论 半巢式PCR法优于PCR-RFLP法,可用于对耐青霉素肺炎链球菌的快速检测;PCR-RFLP敏感性不高,可用于分子流行病学分析.
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一种从血清标本中快速提取HBVDNA方法的建立
目的:建立一种快速提取血清标本中HBV DNA的方法,即裂解液煮沸法.方法:以碱裂解法和经典的苯酚法为对照,比较3种方法提取的HBV DNA纯度和半巢式PCR后的阳性率.结果:用裂解液煮沸法提取的HBV DNA进行半巢式PCR的阳性率高,与两种对照方法之间的差异有极显著意义(P<0.01).结论:裂解液煮沸法是一种快速、简单、高效的提取血清中HBV DNA的方法.
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半巢式聚合酶链反应扩增全血中梅毒螺旋体polA基因
目的 探讨半巢式聚合酶链反应(PCR)扩增梅毒螺旋体(Tp)的DNA多聚酶Ⅰ基因(polA)以探讨检测全血标本中微量Tp的可行性. 方法 应用半巢式PCR和常规PCR分别扩增165例可疑梅毒及非梅毒患者全血中Tp的polA,与血清学方法比较,探讨半巢式PCR方法在扩增全血中Tp DNA的意义. 结果 待测的165例标本中,与血清学方法比较,半巢式PCR检测Tp的敏感性和特异性分别为62.7%和95.9%,两者符合率为82.4%;两种PCR方法检测结果差异有显著性(P<0.01),半巢式PCR敏感性远高于常规PCR. 结论 半巢式polA PCR检测全血中Tp较常规PCR灵敏,是血清学方法诊断梅毒的有效补充,但其检测的灵敏度仍有待进一步提高.
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一期梅毒半巢式聚合酶链反应检测的效果
目的 探讨半巢式聚合酶链反应(PCR)在一期梅毒早期诊断中的意义.方法 应用半巢式PCR检测一期梅毒溃疡组织液和血清中TP-DNA,与TPPA结果进行比较.结果 60例临床诊断为一期梅毒患者,溃疡组织液、血清半巢式PCR和TPPA检测的阳性分别为56例(93.33％)、13·例(21.67％)和53例(88.33％).组织液半巢式PCR检测结果与血清半巢式PCR检测结果比较,差异有统计学意义(P＜0.05),与TPPA结果比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 半巢式PCR检测一期梅毒溃疡组织液中TP-DNA较检测血清中的TP-DNA敏感性高、特异强,可做为TPPA诊断早期梅毒的有效补充.
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限制性内切酶结合半巢式PCR法检测人肝癌P16抑癌基因启动子区甲基化研究
目的 建立甲基化敏感的限制性内切酶结合半巢式降落PCR方法,研究原发性肝癌P16基因启动子区甲基化状态.方法 针对P16基因启动子区富含CpG的序列,设计3条引物,进行半巢式降落PCR扩增,检测原发性肝癌P16基因启动子区甲基化状态;并将P16基因启动子区340 bp片段克隆到pMD18-T载体,E.coli JM109扩增此质粒后经CpG甲基化酶M.Sss Ⅰ处理,再用Hpa Ⅱ酶切验证获得P16基因启动子区甲基化阳性的质粒P16Pm+并进行特异性和灵敏度实验.以此甲基化敏感的限制性内切酶结合半巢式降落PCR方法检测40例人原发性肝癌和3例正常人肝组织DNA样品的P16基因启动子区甲基化状态.结果 所采用的Hpa Ⅱ酶切后半巢式PCR方法的特异性强,灵敏度达100 fg;对40例人原发性肝癌组织DNA样品P16基因的启动子区甲基化状态检测显示甲基化阳性率为30%(12/40),3例正常人肝组织均为阴性(0/3).结论 P16抑癌基因启动子区甲基化可能与肝癌发生发展有关.本实验方法简便、成本低廉,并有高度的特异性与灵敏度,在大规模检查中有实际应用价值.
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半巢式PCR-RFLP法快速鉴定临床标本中的皮肤癣菌
目的 探索快速鉴定皮肤癣菌病临床标本中致病菌的分子生物学方法.方法 以皮肤癣菌的基因组DNA为模板,采用一对半真菌通用引物(NS5、ITS1、ITS4)行半巢式PCR扩增rDNA上的ITS段,用限制性内切酶BciT130 Ⅰ及Dde Ⅰ酶切目的片段,凝胶电泳.结果 7种65株常见皮肤癣菌培养菌株和17例临床标本的半巢式PCR-RFLP图谱特异;且临床标本与相应的培养菌株酶切图谱一致.结论 半巢式PCR-RFLP方法适合培养菌株和临床标本病原菌的快速准确鉴定.
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弓形虫半巢式PCR检测方法的建立
根据GenBank上公布的弓形虫RH株的P30基因(X14080)设计了3条特异性引物P1、P2和P3,建立了半巢式PER检测体系,并将P1和P3的扩增产物克隆到pUCm-T载体上进行测序.结果表明,该体系能够扩增出约250bp的片段,P1和P3能扩增出约500bp的片段,克隆到pUCm-T载体上的504bp片段与P30基因(X14080)的序列同源性为99.8%.该PCR检测体系的特异性强,不能在健康猪血液、猪链球菌、多杀性巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌和猪圆环病毒DNA上扩增出条带;敏感性高,低检测的DNA含量为18fg.
