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我国新疆首次检出西伯利亚型蜱传脑炎病毒
对新疆地区蜱传病毒类群进行调查,本研究利用Illumia深度测序技术对新疆全沟硬蜱体内的病毒小RNA分子进行筛查,从提取的蜱小RNA组份中共测得32 631条病毒特异性读序,77条读序与蜱传黄病毒基因组序列匹配,核苷酸数合计约占病毒基因组的3.8％～2.4％,其中32条读序与国内尚未发现的西伯利亚型蜱传脑炎病毒一致.为对上述结果进行确证,利用RT-PCR对此型病毒核酸进行检测,从蜱总RNA中分别扩增获得病毒包膜基因与基因组3 '末端片段,测序比对表明上述片段序列与西伯利亚南部检出病毒高度近似,核苷酸与氨基酸似然率分别为97.2％～95.5％与99.4％～98.3％.综上所述,本研究利用基于深度测序的病毒筛查方法,首次从我国新疆蜱传脑炎疫源地检出西伯利亚型病毒,为下一步针对病毒的分离与流行病学调查提供了重要线索.
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上海出入境检验检疫局发现我国首例库波热病毒
针对西非安哥拉回国的不明原因发热病人,筛查其可能携带的传染病病原体.采用荧光PCR的方法对口岸重点关注的黄热病毒、寨卡病毒、登革病毒等病原体进行筛查;采用深度测序的方法,搜索病毒库、细菌库、寄生虫库,进行序列比对筛查各类病原体,采用全基因组测序的方法获得病原体全基因组序列.2017年1月2日凌晨1点,上海出入境检验检疫局国家国境口岸卫生监督检测重点实验室接到一份紧急样本,样本来自1名安哥拉回国的28岁男子.该男子在安哥拉当地医院初筛黄热病阳性,该男子要求自行回国治疗.针对病人的血液样本和尿液样本,开展黄热病毒、登革病毒、寨卡病毒、裂谷热病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗病毒、流行性乙型脑炎病毒、疟原虫等多种虫媒病原体的荧光PCR检测,结果显示阴性.通过对血液样本的深度测序发现,该病人感染了一种新型的弹状病毒,中文命名为库波热病毒,并获得了库波热病毒全基因组序列,与尼日利亚发现的库波热病毒比较,同源性为96％.
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利用深度测序技术发现新疆库蚊黄病毒
目的：对我国新疆地区蚊虫携带的病毒类群进行调查，并快速发现医学重要的蚊媒病毒。方法利用Illumina深度测序技术筛查野生库蚊体内的病毒源性RNA，利用RT-PCR进行验证，通过序列比对分析病毒亲源关系。结果深度测序技术共检出144条库蚊黄病毒特异性读序，拼接获得7个不连续的病毒基因组重叠群片段。 RT-PCR扩增产物能够覆盖重叠群间隙序列。在此基础上，重构获得病毒基因组5′和3′末端片段（约678 nt、411 nt）。对5′末端序列比对分析结果表明，新疆库蚊黄病毒属于北美/亚洲基因亚型，与国内发现的库蚊黄病毒共同形成一个独立分支，核苷酸序列同源性为98．2％～99．5％，氨基酸序列同源性高于95．5％。结论深度测序技术成功应用于新疆地区虫媒病毒的快速甄测，首次从新疆地区发现库蚊黄病毒，为虫媒病毒监测提供了一条新途径。
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HBV基本核心启动子和前C区变异的深度测序分析
目的：利用Ion Torrent PGM深度测序技术，探讨乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）阳性慢性乙型肝炎（CHB）患者乙型肝炎病毒（HBV）基本核心启动子和前C区突变特征。方法收集HBeAg阳性CHB患者血清样本25例，提取HBV DNA，采用巢式PCR方法扩增HBV基本核心启动子和前C区片段，构建深度测序文库，基于Ion Torrent PGM平台深度测序，生物信息学分析突变位点及其突变率；构建HBV基本核心启动子和前C区突变型和野生型参考质粒，作为深度测序质控品。结果在25例HBeAg阳性CHB患者HBV基本核心启动子和前C区检出流行率达20%的突变位点10个：G1746A、A1752G/T、T1753C/G、A1762T、G1764A、C1817G/A、T1825C/A、A1846T、G1896A、G1899A；G1746A和T1825C/A的流行率分别达92%和100%。突变位点在HBV B基因型和C基因型感染者的分布情况显示，A1752G/T和G1896A主要流行于B基因型感染者（63.6% vs 0.0%，χ2=12.374、P =0.0007；72.7% vs 28.6%，χ2=4.812、P =0.0472），A1762T和G1764A主要流行于C基因型感染者（27.3% vs 78.6%，χ2=6.579，P =0.0172）；C基因型感染者A1762T/G1764A突变率显著高于B基因型感染者，但差异无统计学意义（25.7%±28.4% vs 68.4%±42.7%，t =1.614、P =0.1326）。25例HBeAg阳性CHB患者中，32.0%患者仅有A1762T/G1764A突变，24.0%患者仅有G1896A突变，24.0%患者同时携带A1762T/G1764A和G1896A突变。结论深度测序分析可用于定量检测HBV基本核心启动子和前C区突变，为HBV突变研究的临床应用提供了技术平台。
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深度测序用于分析抗病毒治疗急性期感染者的HIV-1准种群变化
目的 建立针对艾滋病病毒Ⅰ型(HIV-1)三个基因区片段的Illumina Hiseq深度测序(简称Hiseq测序)方法,并尝试用于分析抗病毒治疗急性期感染者的HIV-1准种群变化规律.方法 对2例在急性期启动抗病毒治疗的HIV-1感染者进行随访检测,直至第96周.提取外周血单个核细胞(PBMC)中的脱氧核糖核酸(DNA),对基线血液样本进行HIV-1基因亚型分析.分别以gag、pol和env基因区为目的片段,对基线及随访样本进行巢式聚合酶链反应(PCR),扩增产物经一代测序确认无误后纯化、混合构建DNA文库,进行Hiseq测序.分析HIV-1准种群分布,计算基因离散率,并做系统进化树分析.结果 接受抗病毒治疗后,2例感染者体内的HIV-1病毒载量下降,到第12周后无法检出;CD4+T淋巴细胞数在治疗第2、4周时有所下降,随后回升.2例感染的HIV-1毒株分别为CRF01 AE亚型和CRF07_BC亚型.核酸扩增成功的样本全部成功进行了Hiseq测序,每个目的基因区片段都获得了十万级的序列数.在基线点,频数高的第一个准种群序列的频数占全部序列总频数的比例均超过50％.抗病毒治疗后,准种群的分布发生不同程度的变化,其中频数第一准种群频数所占比例先减小,从第12周起多数增大,第72周再减小.样本内平均基因离散率整体稳定,小范围波动.每个样本3个基因区各随访时间点与基线点之间的平均基因离散率在治疗第2周增大,随后保持稳定.系统进化树显示,不同时间的准种群序列散在分布且距离接近.结论 针对HIV-1 gag、pol和env基因区的Hiseq测序方法可有效用于分析HIV-1准种群的变化规律,早期抗病毒治疗可降低病毒载量调定点且延长准种群分散时间.
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人巨细胞病毒潜伏感染状态下编码miRNA的研究
目的：探索潜伏感染状态下人巨细胞病毒（HCMV）所编码微小RNA（microRNA，miRNA），为研究其在HCMV病毒学和潜伏感染机制奠定基础。方法通过HCMV感染THP－1细胞构建HCMV潜伏感染细胞模型，采用高通量Solexa测序平台对其深度测序，并利用 RNAFold 等生物信息学软件进行二级结构预测和命名。结果HCMV在潜伏感染状态表达了miR－US25－2－3p、miR－US25－2－5p、miR－UL112、miR－US25－1、miR－UL22A 以及长度为25 bp的编号为PC－5p－148467的miRNA，对PC－5p－148467进行系列分析，将其命名为hcmv－miR－US33as－5p。结论在潜伏感染状态下，HCMV亦可编码多种miRNA。
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基于深度测序的循环肿瘤DNA检测在肿瘤诊治中的应用进展
循环肿瘤DNA为血液中与肿瘤相关的游离核酸,可作为肿瘤诊治的标志物.基于深度测序的循环肿瘤DNA检测在肿瘤诊治中具有高通量、高灵敏度、微创、一定程度上能克服肿瘤异质性等优势,在评估肿瘤动态和肿瘤负荷、检测微小残留病灶和复发风险预测、个体化用药指导和预后评估等方面显示出很高的价值.本文将对基于深度测序的循环肿瘤DNA检测在肿瘤诊治中的应用做一综述.
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MiRNA在E3泛素连接酶Cbl-b抑制CD4+T细胞活化中的作用研究
本研究探讨miRNA在Cbl-b抑制CD4+T细胞活化中的作用机制.采用miRNA深度测序的方法检测WT CD4+T细胞、Cbl-b-/-CD4+T细胞、抗CD3抗体活化的WT CD4+T细胞和抗CD3抗体活化的Cbl-b-/-CD4+T细胞中miRNA的表达谱.结果显示,miR-125b-2-3p、miR-125b-5p、miR-99a-5p和miR-99a-3p同时在Cbbb-/-CD4+T细胞和抗CD3抗体活化的Cbl-b-/-CD4+T细胞中显著高表达.运用miRWalk2.0预测差异表达miRNA的靶基因并用GO和KEGG分析差异表达的miRNA的可能作用机制.结果显示差异表达的miRNA可能通过MAPK等信号通路来影响Cbl-b抑制CD4+T细胞的活化.综上所述,Cbl-b可能通过miR-125b-2-3p、miR-125b-5p、miR-99a-5p和miR-99a-3p等miRNA调控MAPK等信号通路来抑制CD4+T细胞的活化.
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新一代测序技术在临床微生物检测中的应用
1975年, Frederick Sanger等发明了双脱氧链终止法 (Sanger法) 核酸测序技术, 该技术以其高准确率、读长较长的特点在人类基因组计划及相关科研领域的研究中取得了重大成就.然而, Sanger测序成本高、测序速度慢、通量低的缺点限制了其大规模推广应用.基于此背景, 新一代的测序技术应运而生.新一代测序 (next-generation sequencing NGS) 也被称为深度测序、高通量测序或大规模平行测序, 是一组较一代测序通量更高、成本更低、用时更短、自动化程度更高的测序技术, 其主要测序平台目前有Solexa、SOLiD、454等.成本低、高通量的优越性, 使NGS被大规模投入科研及临床应用成为可能.
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深度测序法在检测HCV不同基因型/亚型混合感染中的应用
目的 将深度测序法用于HCV感染者中不同基因型/亚型混合感染的检测.方法 2例HCV RNA阳性血浆标本(标记为1和2号标本),以NS5B.和E1编码区为目的基因,经RT-PCR扩增后做sanger核苷酸序列测定,对其做基因分型发现2个编码区的分型结果后,重复3次NS5B基因PCR扩增;合并3次PCR产物用Ion TorrentTM半导体测序仪做深度测序.获得的序列用Geneious软件的“The map to reference algorithm”和“De novo assembly”2种方法做序列分析和比对,并用Mega 5构建进化树.结果 sanger测序:1、2号标本NS5B基因分型均为1b,E1基因分型均为2a;深度测序:2个标本均为HCV1b与2a混合感染,其中The map to reference algorithm(Geneious)方法显示,1号标本中1b占92.7％、2a占3.8％、没有比对到的序列(unused seq)占3.5％,2号标本相应为84.3％、5.4％,没有比对到的序列占10.3％;De novo assembly(Geneious)方法显示,1号标本中1b占96.3％、2a占3.7％,2号标本相应为94.1％、5.9％.结论 深度测序技术可以精确地获得HCV混合感染的不同基因型/亚型信息,De novo assembly(Ge-neious)分析HCV的深度测序数据更为精确和直观.
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健康管理与深度测序数据解析的挑战
介绍深度测序技术对生物医学研究和社会的影响,讨论深度测序数据解析及其在健康管理应用中所面临的挑战和机遇,包括数据存取、计算技术、数据应用、人才缺失与跨学科人才教育等方面.
