首页 > 文献资料
-
流式细胞技术在毒理学研究中的应用
流式细胞仪(FCM)是在上世纪70年代发展起来的一种测量细胞荧光染色强度,定量测定细胞和亚细胞成分(微粒)的细胞分析仪.它也是在单细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质进行快速测量并可分选高纯度细胞亚群的一项新技术[1].近年来,随着细胞和分子生物学技术尤其是单克隆抗体技术的发展和分子探针的开发,流式细胞技术日见成熟,它以快速、灵活、灵敏和定量的特点,在国内外被广泛应用于医学基础研究和临床实践多方面.目前,流式细胞技术在毒理学多个分支研究领域已得到广泛应用,在研究外源化合物的细胞毒性和致癌分子机理方面显现出重要价值.笔者就目前FCM技术在免疫毒理、生殖和遗传毒理、发育毒理、环境以及神经毒理学方面的应用作一综述.
-
环加氧酶-2过表达可能预示前列腺患者治疗无效(英)
人体某些类型的肿瘤(包括前列腺癌)存在环加氧酶-2(COX-2)过表达.COX-2的过表达也可能涉及到肿瘤对化疗和放疗的拮抗.作者分析了放疗肿瘤学协作组(RTOG)1992--2002年的临床实验资料,发现了COX-2与前列腺癌预后的关联.该研究样本包括586例前列腺癌患者(T2c-T4期),平均年龄70岁(范围43～88岁),随机分为长期治疗组(28个月,n=316)和短期治疗组(4个月,n=270),给予新辅助化疗,同时辅助雄性激素剥夺疗法(ADT)加放疗.对经尿道切除或粗针活检获取的组织标本分析COX-2染色强度.
-
胆固醇对兔胆管成纤维细胞增生的影响
目的:研究胆固醇(CL)对兔胆管成纤维细胞增生的影响,并对其机制进行探讨.方法:分离、纯化、培养兔胆管成纤维细胞,完全随机分为两组:对照组、中等浓度胆固醇组(0.6 g/L)和高浓度胆固醇组(1.2g/L).以MTT法测定各组细胞的增生情况、并以流式细胞仪(FCM)测定细胞周期.进而采用免疫组化法定量分析各组细胞内增生细胞核抗原(PCNA)的表达情况.结果:中等浓度CL(0.4～0.8 g/L)可以使培养的兔胆管成纤维细胞MTT A490nm值显著升高,L(0.4 g/L)A490nm值为0.422±0.015,较对照组增加51.4%(P＜0.05);CL(0.6 g/L)A490nm值达到大为0.486±0.019,较对照组增加95.2%(P＜0.01);0.8g/LCL组A490nm值为0.472±0.017较对照组增加89.6%(P＜0.01);高浓度CL(1.2 g/L)明显抑制细胞生长,490nm值为0.163±0.018,较对照组下降34.5%(P＜0.05).流式细胞仪分析显示,与正常组相比,中等浓度CL(0.6 g/L)显著增加G2/M期细胞比例,从9.8%上升为13.0%,期细胞比例从11.7%上升为33.4%,而显著减少进入G0/G1期的细胞比例,从78.5%下降为53 6%高浓度CL(1.2 g/L)显著减少G2/M期细胞比例,从9.8%降低为6.7%,期细胞比例从11.7%下降为5.9%,而显著增加进入G0/G1期的细胞比例,从78.5%上升为87.4%,使更多的胆管成纤维细胞处于相对静止期.PCNA免疫组织化学实验表明,对照组胆管成纤维细胞的PCNA染色,核内无明显的阳性反应颗粒,染色强度为88.3±11.6%AU;0.6 g/L CL组胆管成纤维细胞的PCNA染色强阳性,染色强度为126.3±10.2%AU(P＜0.05,vs 对照组),可见胞核内呈现棕褐色颗粒;1.2g/LCL可使胆管成纤维细胞核内棕褐色颗粒显著减少,染色强度为96.3±11.4%AU(P＜0.05,s中浓度CL组)结论:中等浓度胆固醇促进兔胆管成纤维细胞增生,其机制可能与细胞内PCNA的表达有关.
-
三七总皂甙对大鼠肝纤维化防治机制
目的:观察三七总皂甙对实验性肝纤维化的防治作用,并探讨其可能的机制.方法:以CCl4、乙醇及胆固醇诱导大鼠肝纤维化模型,同时给予三七总皂甙干预组三七总皂甙腹腔注射.设立模型对照组和正常组.于造模6 wk后大鼠全部处死,取血清及肝组织标本.应用放射免疫法检测血清PCⅢ、LN含量,HE染色观察肝组织形态学改变,VG染色测定肝组织纤维表达情况,免疫组织化学测定肝组织desmin、α-SMA、ICAM-1、LN、Ⅰ和Ⅲ型胶原.结果:与模型组比较,三七总皂甙组大鼠血清PCⅢ、LN含量均明显降低;形态学改变明显轻于模型组;肝组织desmin、α-SMA、ICAM-1染色强度均明显减弱;三七总皂甙组肝组织LN、Ⅰ和Ⅲ型胶原染色轻于模型组,但差异性不显著.结论:三七总皂甙对实验性肝纤维化形成具有一定的抑制作用.其作用机制可能与抑制HSC活化,诱导活化的HSC凋亡,减少Ⅰ、Ⅲ型胶原和LN表达,并减轻肝窦毛细血管化有关.
-
颅内转移性肉瘤32例病理、免疫组化及电镜观察
颅内转移性肉瘤少见.复习文献到2000年止,国外有少数报告[1～6],国内尚未见有单独报告.鉴于该瘤少见和光镜检查有时易误诊,现将32例颅内转移性肉瘤的病理、免疫组化和超微结构观察结果报告如下.1 材料与方法对1956～2000年间我院653例颅内转移性肿瘤中的32例颅内转移性肉瘤进行统计分析(其中6例来源于尸检资料).所有肿瘤重新切片,HE染色、光镜观察.对32例作10种免疫组化:波形蛋白(Vimentin)、上皮膜抗原(EMA)、黑色素瘤抗体(HMB45)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、肌红蛋白(Myoglobin)、B细胞抗体(L26)、骨连结蛋白(Osteonectin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、α1-胰糜蛋白酶(α1-ACT)、神经丝蛋白(NF).染色阳性结果显示瘤细胞胞浆内或胞膜上有棕黄色颗粒,只记阳、阴性结果,不记染色强度.对其中23例按常规电镜制样,JEM-100B透射电镜观察.
-
黑素细胞移植与白癜风的治疗
白癜风的治疗有光化学疗法(PUVA)、外用皮质类固醇[1]以及多种内、外用疗法，但即使是应用广泛的PUVA疗法，经长期治疗者也只有少数患者痊愈。有人用免疫组化方法[2]研究了白癜风患者色素脱失的原因，发现其皮损部位黑素细胞缺失，而非皮损部位黑素细胞数目正常，且其染色强度与形态与正常无差别。1971年，Falabella[3]首次报告以自体表皮移植治疗白癜风获得成功，此后Suvan-prakorn等[4]做了大量这方面的研究工作，90年代Falabella[5]又以自体皮肤点状移植治疗白癜风获得成功。特别是近年来黑素细胞体外培养技术的突破性进展，使人们可以将经体外培养的自体黑素细胞用于皮损部位的移植并取得成功，这无疑为白癜风的治疗带来更大的希望。本文旨在对在白癜风的治疗中与黑素细胞移植有关的内容做一综述。
-
真皮内单核-巨噬细胞形态分析
单核-巨噬细胞是真皮内重要的免疫细胞.CD68是这些单核-巨噬细胞的重要标志.我们发现在正常人的真皮浅层存在呈网状分布的CD68阳性细胞,这些细胞在形态和染色强度上存在一定的差异[1].为进一步研究这些细胞的差异,我们采用图像分析方法,对正常真皮内的单核-巨噬细胞的形态及染色强度进行分析,探讨真皮内这类细胞的形态特点.
-
垂体腺瘤侵袭性与IL-8分泌有关
第四军医大学西京医院全军神经外科研究所完成的一项国家自然科学基金资助项目证实，垂体腺瘤的侵袭性与白细胞介素8(IL-8)的表达和分泌有关，可作为检测垂体腺瘤侵袭性高低的指标之一。该所研究人员用免疫组织化学检测32例垂体腺瘤标本中IL-8的表达水平。酶消化法对手术切取的垂体腺瘤组织作原代培养，收集细胞培养上清，双抗体夹心ELISA法测定IL-8含量。对组织学染色进行图像分析，结合肿瘤的侵袭性、病理分级等进行统计学检验。结果显示，所有垂体腺瘤标本均为IL-8阳性，侵袭型垂体腺瘤的IL-8阳性细胞明显多于非侵袭型垂体腺瘤，IL-8阳性染色强度也明显高于非侵袭型垂体腺瘤。所有原代培养的垂体腺瘤细胞均有IL-8分泌，侵袭型垂体腺瘤细胞上清液中IL-8的含量明显高于非侵袭型垂体腺瘤。IL-8的表达和分泌水平与患者性别、年龄以及分级无明显相关性。研究结果说明，垂体腺瘤侵袭性与IL-8的合成和分泌有关。提示IL-8的表达和分泌水平在垂体腺瘤的侵袭性和预测复发方式方面提供了有用的分子标记，对患者预后判断以及术后辅助治疗方案的制定具有重要的参考价值。
-
经他莫昔芬治疗的乳腺癌ER、PR阳性率和染色强度与预后的关系
目的 分析经他莫昔芬治疗的乳腺癌ER和PR的阳性率和染色强度与患者预后的关系及免疫组化检测结果 的重复性,探讨ER和PR检测后理想的报告方法.方法 采用全自动免疫组化BenchMark XT染色系统检测223例经他莫昔芬治疗的乳腺癌组织中ER和PR的表达,分析阳性率和染色强度与患者预后的相关性;对其中30例进行ER重复染色和3位医师重复判读的对比分析.结果 (1)Kaplan-Meier法描绘生存曲线分析显示,ER高阳性率组(67%～100%)、中阳性率组(34%～66%)患者的无瘤生存率和总体生存率明显好于低阳性率组(1%～33%)(P=0.007,P=0.003);PR高阳性率组(67%～100%)、中阳性率组(34%～66%)患者的无瘤生存率和总体生存率明显好于低阳性率组(1%～33%)(P=0.004,P=0.005).(2)Kappa分析显示,3位医师间ER阳性率重复性较好(0.727、0.733、0.710),肿瘤细胞染色强度重复性一般(0.593、0.620、0.610).结论 乳腺癌组织中ER、PR阳性率与内分泌治疗疗效和预后关系密切,且阳性率也有较好的重复性.病理诊断报告除应阐明乳腺癌细胞ER、PR阳性/阴性的定性结果 外,纳入阳性率信息是必要的,肿瘤细胞染色强度是否需要纳入值得进一步研究.
-
细胞角蛋白在鉴别乳腺乳头状瘤和乳头状导管原位癌中的作用
乳腺乳头状肿瘤是指由向腔内突起,形成纤维血管轴心的,并可演变成树枝状结构的增生的乳腺上皮组成的肿瘤,主要为导管内乳头状瘤和乳头状导管原位癌(DCIS).尽管这两种肿瘤的组织形态学特征已有很好的描述,但在实际工作中有时区分它们还是很困难.为了寻找能够区分这两种肿瘤,作者采用免疫组化方法分析了新加坡国立医院50例乳头状肿瘤(乳头状瘤25例和乳头状DCIS 25例)中CK5/CK6、CK14和34βE12的表达,结果采用免疫积分计算(染色细胞比例×染色强度).
-
肿瘤转移消失蛋白在直肠癌组织中的表达
肿瘤转移消失( MIM)蛋白又称肿瘤转移抑制(MTSS1)蛋白,与多种肿瘤的生长转移过程密切相关[1].本研究旨在观察MIM蛋白在直肠组织中的表达,并分析其对直肠癌的临床意义.一、材料与方法1.病理标本及免疫组织化学染色:直肠癌组:143例,直肠腺瘤组:14例,直肠正常组织:37例.MIM抗体(兔多克隆抗体)及二抗购白美国eBioscience公司.采用LAB VISION 2D全自动免疫组织化学染色仪,Elivision二步法进行染色.2.结果判定:胞膜及胞质被染成棕黄色为阳性反应.以染色强度和阳性百分比的乘积＞3分为免癌反应阳性.
-
原发性肝细胞癌分化程度与诱生型一氧化氮合酶表达的关系
我们采用免疫组织化学的方法检测诱生型一氧化氮合酶 (iNOS) 在原发性肝细胞癌(HCC)及癌旁组织(PCHT)中的表达，探讨其与HCC临床病理资料的相关性，观察一氧化氮(NO)在HCC发生、发展中的作用，现将结果报道如下。 一、对象与方法 1.标本：随机取我院1996～1999年手术切除的肝脏标本共50例，HBsAg均为阳性患者，术后病理证实均为HCC，其中30例有PCHT。取肝破裂伤患者肝组织8例为正常对照。将HCC标本按Edmondson's标准分级。iNOS免疫组织化学染色按ABC法操作。同时设置空白对照和阴性对照。 2.结果判定：iNOS免疫组织化学染色以细胞膜/浆内出现棕黄色颗粒为阳性，染色结果综合染色强度及阳性细胞数量两个方面进行半定量分析，分别评分0～3分。染色强度：阴性为0分；浅黄色但明显高于阴性对照为1分；棕黄色为2分；棕褐色为3分。阳性细胞数≤1/ 3为1分；1/3～2/3为2分；≥2/3为3分。根据两项指标相加分数划分为4级：0～1分为“-”；2分为“+”；3～4分为“”；5～6分为“”。 3.统计学处理：HCC和PCHT的iNOS表达程度比较采用两样本比较的秩和检验。HCC各级间采用多个样本比较的秩和检验并在此基础上做多个样本间的两两比较的秩和检验。 二、结果 iNOS广泛存在于正常肝细胞、PCHT细胞、枯否氏细胞及HCC部分细胞中。在正常肝组织和肝硬化组织中iNOS为细颗粒均质性表达于胞浆中，细胞膜上偶见，前者为弱表达，后者为强表达，胞核内及间质细胞内无iNOS表达。在HCC细胞中iNOS的表达差异较大，从弱至强均可见到，部分癌细胞中甚至无表达，iNOS以细或粗颗粒状存在。HCC和PCHT中iNOS的表达差异有非常显著性(P＜0.01)，即前者明显低于后者(表1)。Edmondson's分级中 Ⅰ级HCC中iNOS表达明显高于其他3级，且差异均有非常显著性(P＜0.01)，在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 3级iNOS表达差异无显著性(P＞0.05，表2)。 三、讨论 本研究结果显示，在正常肝组织中，iNOS的表达为弱阳性，说明iNOS催化产生的NO与肝脏的正常生理功能有关。HCC中iNOS的表达较PCHT中的表达为低，两者差异有显著性。有研究证明肿瘤组织中NO产生的大量有一个平台期，这时机体对肿瘤的免疫力强，平台期之后，随着NO产生量的下降，机体对肿瘤的免疫能力随之崩溃，肿瘤则发生转移和扩散［1］。以上观点与临床所见的小肝癌多有包膜，而未发生肝内转移前生长较慢，而一旦包膜被浸润，发生肝内转移后生长明显增快的现象相符。而不同分级的肝癌组织中iNOS 表达水平不同也可能和游离的HBsAg有关。 PCHT和Ⅰ级HCC中HBV与宿主DNA整合较少，故游离的HBs Ag浓度高，iNOS的表达强，NO产生多，从而抑制了肿瘤细胞的发生、发展。在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级 HCC中，由于游离的乙肝病毒(HBV)较少，而细胞表型和基因型的突变机率高(包括iNOS基因) 。iNOS的表达弱，NO的产生较少，对HCC的抑制减弱，故HCC的恶性程度高，生长较快。已知 NO对细胞的生长具双向的生物效应，即低浓度时能够抵抗氧化损伤，从而保护肿瘤细胞。但当NO浓度提高时能够增强其对细胞的杀伤作用［2,3］，与本研究中Ⅰ级HCC中iNOS表达强、生长慢，其他3级中iNOS表达弱而生长较快相符合。本研究结果提示，NO可能是机体抗肝癌免疫的组成部分，正确诱导iNOS，合理利用其催化产物NO将对肝癌的治疗有一定的帮助。
-
部分背根切断对脊髓中央管上皮细胞凋亡的影响
本室近研究发现,部份背根切断可激发脊髓部份胶质细胞和神经元凋亡,且切断一侧背根对非手术侧的细胞凋亡也有影响.已知的研究结果提示导致非手术侧细胞凋亡的激发因素并非直接损伤.目的:本文进一步探讨部份背根切断与脊髓中央管上皮细胞凋亡的关系.方法:将15只成年猫分为三组,每组5只,其中两组行单侧部份背根切断术(切除L1-L5,L7-S2DRG保留L6 DRG为备用根),术后动物存活3 d及10 d,取三组动物的L3脊髓石蜡包埋切片后按常规方法行DNA原位末端标记-TUNEL法染片,快红显色显示中央管上皮的凋亡细胞.观察并计数上皮细胞凋亡数及染色强度.结果:正常组,仅见个别TUNEL阳性反应细胞(5.5±1.7),反应强度(+).术后3 d ,中央管上皮出现大量TUNEL阳性反应细胞(84.7±7.4),反应强度(+++).10天组:仅见少数TUNEL阳性细胞(27.3±3.2),反应强度(+).各组间阳性细胞数的比较均有显著差异(P＜0.05).结论:尽管中央管上皮与背根切断无直接关系,但术后3 d时中央管上皮亦有大量细胞凋亡.该结果进一步提示细胞凋亡可能在损伤的间接影响下发生.另外,从不同时相中央管上皮细胞凋亡的数目来看,我们提出两种设想,一是中央管凋亡的上皮细胞有否可能逆转,二是在细胞凋亡的同时是否伴有大量的细胞增殖.若不存在上述可能,那么,难于解释术后10 d时尚有大量中央管上皮细胞存在.
-
去卵巢对大鼠心肌损伤及二仙汤的保护作用研究
目的：探讨去卵巢对大鼠心肌损伤及二仙汤的保护作用。方法：13周雌性SD大鼠36只，随机分为对照组、模型组、雌激素组和二仙汤组，灌胃给药12周。 ELISA法检测血清雌二醇（ E2），HE染色、电镜观察心肌病理学及超微结构，免疫组化检测心肌雌激素受体α（ ERα）和雌激素受体β（ ERβ）表达。结果：模型组E2明显降低，雌激素和二仙汤治疗组E2升高。 HE染色：模型组心肌排列紊乱，肌纤维间隙增宽，可见肌浆凝集，细胞体积变小，胞内发现空泡，内膜下可见心肌纤维化。治疗组心肌病理改变明显减轻。电镜：模型组心肌细胞水肿，肌原纤维走向不规则、肌丝甚至断裂，线粒体肿胀，嵴断裂或消失，二仙汤组病理变化较模型组明显减轻。免疫组化：模型组ERα和ERβ阳性细胞数明显下降，染色强度变浅，治疗组染色强度增加但低于对照组。结论：去卵巢对大鼠心脏损伤明显，二仙汤通过调节血液E2水平及心肌ER等途径保护受损心肌。
-
三种粘片剂及不同烘烤温度和时间对免疫组化切片的影响
免疫组织化学染色过程中,因步骤多、微波高温修复、37℃孵育等因素,常出现脱片问题 ,造成染色的失败,浪费人工及试剂.为了解决脱片问题,同时又不使抗原或抗体受到破坏 ,我们选取了经免疫组化染色确定为强、中、弱三种反应强度的标本,分别用硌矾明胶、A PES(3-Amino Propyltriethoxy Silane)、多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine)三种粘片剂处理切片,再将切片经37℃、50℃、6 0℃三种烘烤温度分别烤片1hr、2hr、3hr、4hr及12hr,使用同样方法及程序染色,观察切片的肉眼观、粘贴程度及抗原抗体保存情况,结果为:1.三种粘片剂对防脱片效果均较好,对抗原抗体均无影响,只是硌矾明胶处理的切片经复染后,切片外观着色,给人不干净的感觉;多聚赖氨酸较贵(150元/10ml),AP ES经济实用(40元/10ml).2.三种烘烤温度对切片的影响:37℃时需烤片12hr以上切片才粘贴牢固,但有时也有脱片,50℃需3hr以上,60℃烤1～2hr即可.3.五种烘烤时间对切片的影响:37℃时,1hr、2hr、3hr、12hr均有脱片现象,时间越短,脱片越多.50℃3hr～4hr效果较好,60℃时1hr～2hr效果较好,50℃及60℃时烘烤12hr及以上,染色强度减弱,说明有抗原或抗体丢失.综上所述,对于常规的免疫组化染色,以用APES处理,60℃烤片1hr～2hr为佳选择.
-
微波修复在冰冻切片免疫组化中的应用
微波修复法多用于石蜡切片,我们在长期的研究生免疫组化教学过程中,实行改良,将微波抗原修复法用于冰冻切片,取得了满意的效果,方法如:1.常规固定取脑组织冰冻切片.2.漂洗后3%H2 O2封闭10分钟,蒸馏水洗2分钟3次.3.微波抗原修复:入柠檬酸盐缓冲液(PH6. 0),用微波或电炉加热,循环3次后入1%BSA孵育15分钟.4.入一抗30分钟,转入二抗 20分钟,三抗20分钟,显色.结果讨论:1.与对照切片成比,阳性细胞染色增强,背景变浅,阳性检出率提高.由于常规的冰冻切片免疫组化方法所用的固定剂多含甲醛,醛基与蛋白质中的氨基交联,使抗原决定簇被掩盖,影响了免疫组化染色结果,使背景染色较深,阳性检出率较低.且这种作用随固定时间的增长而加重,用微波修复抗原的方法,可以使抗原决定簇暴露,有利于抗体结合.此外,部分因固定而被损伤的抗原决定簇也得到修复,因此能提高抗原的阳性检出率,增加染色强度,降低背景的非特异性染色.2.染色时间大大缩短.以往为保证染色效果,常规一抗孵育时间较长(12-24小时),而用微波修复后仅需 30分钟.因为微波修复法可使抗原暴露,利于抗原抗体结合,提高了反应速度,节省了时间 .综上所述,在冰冻切片中使用微波抗原修复的方法值得推广.
