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高原缺氧/再给氧毒性损伤与脂质过氧化作用的关系
目的探讨高原缺氧/再给氧毒性损伤与脂质过氧化作用的关系.方法选本校动物研究所提供雄性SD大鼠30只,体重范围在180～220 g,平均体重为(216±15)g,分成对照组(A组)、高原组(B组)、恢复组(C组)3组,每组10只,其中对照组为平原常氧饲养,高原组为高原(海拔3 700 m)缺氧组,恢复组为高原(海拔3 700 m)缺氧后回到平原(海拔600 m)再恢复给氧.实验组和恢复组动物由飞机空运至西藏拉萨市,高原的海拔高度为海拔3 700 m,其中高原组动物在高原饲养5 d宰杀,恢复组动物饲养5 d后空运回西安,与对照组一起宰杀,分别测定有关指标.
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诱导HSP70减轻肠上皮细胞缺氧/再给氧的损伤
目的:观察热休克预处理诱导热休克蛋白70(HSP70)对肠上皮细胞(IEC-6)缺氧/再给氧损伤的影响,并探讨HSP70的细胞保护作用.方法:体外培养IEC-6细胞,随机分为正常对照(C)、单纯缺氧/再给氧(H/R)及热休克预处理组(HS+H/R),免疫组化检测缺氧/再给氧后各组细胞HSP70表达程度,MTT法分析细胞活力,并检测细胞LDH漏出,TUNEL法检测细胞凋亡情况.结果:与C组及H/R组比较,热休克预处理可明显诱导HSP70的产生(0.93±0.07 vs 0.20±0.04,0.39±0.08,P＜0.01),热休克预处理可显著增加IEC-6细胞缺氧/再给氧处理后细胞活力(0.27±0.04 vs 0.24±0.02,P＜0.05),LDH漏出减少(1021.29±207.06 vs 1419.90±393.07,P＜0.05),细胞凋亡率也明显降低(7.8±1.6% vs 12.3±2.9%,P＜0.05).结论:通过热休克预处理诱导HSP70表达,可明显减轻肠上皮细胞缺氧/再给氧损伤.防止肠上皮细胞缺氧/再给氧后细胞凋亡可能是其保护作用机制之一.
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抗氧化剂和糖皮质激素抑制缺氧／复氧时肾小球血管内皮细胞ICAM-1的表达
细胞间粘附分子-1(Intercellular adhesion molecule-l，ICAM-1)主要在内皮细 胞表达，作为白细胞β2整合素家族的配体在中性粒细胞与内皮细胞紧密结合和随后进入 缺血组织中起重要作用。通过降低ICAM-1的表达会减轻缺血／再灌注损伤，这点已在多个 脏器的动物实验中得到证实。已有研究发现糖皮质激素和抗氧化剂，能降低细胞因子刺激下 升高的ICAM-1，本研究旨在探讨抗氧化剂二硫代氨基甲酸吡 咯烷(pyrrolidine dithiocar bamate，PDTC)和糖皮质激素中的地塞米松(Dexamethasone，Dex)对缺氧／再给氧(hypoxia ／reoxygenation，H／R)条件下对体外肾小球血管内皮细胞ICAM-1表达的影响。1 材料与方法 (1)试剂 纯化抗鼠CD54单克隆抗体(IgG)和FITC标记抗鼠IgG二抗(深圳晶美生物工程有限 公司)，Dex和PDTC(美国SIGMA公司)，RPMI 1640细胞培养基(美国GIBCOBRL公司)，小牛血清 (杭州四季青生物公司)。 (2)细胞培养 小鼠肾小球血管内皮细胞株ESDO由长征医院肾内科提供。复苏后，加入 含20％灭活小牛血清的1640培养液，25 cm细胞培养瓶生长，待1～2 d细胞长满瓶底后，以1 08/L浓度接种传代。细胞存活率用台盼蓝染色判断。 (3)方法 向氧分压可调控的Queue细胞培养箱中注入95％的氮气和5％的CO2混合气体 ,使氧分压为零，为缺氧条件。注入空气和5％CO2混合气体为再给氧。缺氧时间为l0 h， 再给氧时间为6 h，PDTC的浓度为50 μmol/L、5 μmol/L，Dex为l00 μmol/L、1 μmo l /L，分别在缺氧前30 min和再给氧时加入。ICAM-1表达的测定：将生长成单层的内皮细 胞用0．2%EDTA在37℃消化l0 min，PBS洗涤后，调整浓度为108/L。取调整好的细胞悬液l 00 μl,加入CD54单克隆抗体20 μl，混匀后室温避光孵育30 min，加FITC标记IgG二抗2 μl 孵育30 min，PBS洗涤2次，固定。阴性对照以FITC标记的同型抗体代替。24 h内EPICS-XL 型流式细胞仪(美国Coulter公司产品)检测。每个样本分析5000个细胞，结果以阳性细胞的 百分率(％)表示。
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缺氧一再给氧时家兔主动脉NO的变化及机制研究
目的:观察缺氧一再给氧时家兔主动脉一氧化氮(nitric oxide,NO)含量的变化并探讨其机制.方法:培养的家兔主动脉内皮细胞(endothelialcell,EC)随机分为四组:(1)对照(C)组一通入空气;(2)缺氧(H)组一通入95%N2与5%CO2气;(3)缺氧一再给氧(H/R)组一在缺氧的基础上通入95%O2与5%CO2气;(4)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)与缺氧一再给氧(SOD+H/R)组一在3之家加入SOD,余同3.测定NO-2含量间接反映NO含量.结果:缺氧、再给氧时H、H/R组NO含量均降低,以H/R组更加显著,SOD可使NO含量增加.结论:缺氧可损伤EC,使NO生成减少;再给氧可促进缺氧的损伤.NO减少的机制与缺氧一再给氧时自由基产生增多有关.
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利用激光扫描共聚焦显微镜观察丹参滴丸对乳鼠心肌细胞缺氧的保护作用
目的:探讨丹参滴丸对培养的乳鼠心肌细胞缺氧/再给氧的保护作用机制.方法:出生3～7 d的大白鼠乳鼠的心脏在无菌条件下取出来,剪碎,经胰蛋白酶消化分离成单个细胞,放入含15%小牛血清的1640培养液内培养36 h,将培养的细胞随机分成:Ⅰ正常对照组;Ⅱ缺氧10 min组;Ⅲ缺氧10 min加丹参滴丸组;Ⅳ缺氧10 min再给氧10 min加丹参滴丸组.缺氧时向培养瓶内通N2,流量为每分钟100个气泡(直径0.5 cm);给氧时向瓶内通O2(含5%CO2),加丹参滴丸组在通气前先加入丹参滴丸,终浓度为40 μg/mL.将实验后的细胞用0.25%的胰蛋白酶从培养瓶内消化下来,加入无血清无酚红的1640培养液清洗,离心后弃上清,用PBS清洗离心5 min,500 r/min,弃上清,加入含10 μmol的Fluo-3/AM染色,37℃恒温水浴锅内孵育1 h,经PBS清洗弃上清,放入无酚红无血清1640培养液内备用.胞内游离钙离子可与钙荧光探针Flio-3结合,产生一种荧光物质,激光扫描共聚焦显微镜(美国Meridian公司生产的Insight plus型),通过发射波长是488 nm的激光,激发细胞内游离钙产生荧光,通过纤维成像系统,可观察及测量出细胞内钙离子平均荧光强度的变化.结果:Ⅰ组细胞内钙离子平均荧光强度为1005.75,Ⅱ组钙离子强度为1509.43,经t检验,P＜0.05,二者有显著差异;Ⅲ组钙离子荧光强度有所减弱,为1217.78,与Ⅰ相比无显著差异(P＞0.05);Ⅳ组钙离子荧光强度为1567.91,与Ⅰ组相比有显著差异(P＞0.05).结论:丹参滴丸对心肌细胞缺血缺氧后所致钙超载有拮抗作用.
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参麦注射液对急性缺氧-复氧心肌细胞凋亡的影响
目的:观察参麦注射液对急性缺氧-复氧后心肌细胞凋亡的影响,并探讨其可能机制.方法:采用出生3天的Wastar大鼠,原代培养心肌细胞.实验分为3组:(1)正常组:心肌细胞不做任何处理,按正常条件培养(含10%胎牛血清的低糖DMEN培养液,青霉素100U/L,链霉素100 mg/L,37℃、5%CO2、91%湿度环境培养).(2)缺氧-复氧组:将心肌细胞进行缺氧-复氧处理.(3)参麦注射液组:心肌细胞复氧同时加入5 mL/L(1g/L)参麦注射液15 min.模型使用化学缺氧法,将Na2S2O4加入无糖、无氧的D-Hank's液中,制成缺氧溶液(pH 7.0-7.4),替换正常培养液使心肌细胞缺氧5min,再将缺氧液换成正常含血清培养液孵育15 min模拟再给氧,复制心肌细胞急性缺氧-复氧(anoxia-reoxygenation,A/R)模型.然后以Annexin V-FITC/PI双染色法,用流式细胞仪检测细胞早期凋亡百分率;激光扫描共聚焦显微镜观察Fluo-3负载的心肌细胞内钙离子水平的变化.
