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妊娠高血压综合征孕妇血清对培养的内皮细胞的影响
近年来，内皮细胞损伤是妊娠高血压综合征(妊高征)发病中心环节的学说［1］已被公认，但造成内皮细胞损伤的原因目前仍不清楚。本研究通过观察妊高征患者血清对培养的脐静脉内皮细胞增殖、细胞凋亡和细胞间粘附分子1(ICAM-1)表达的影响，探讨妊高征发病的机理。 一、资料与方法 1.孕妇血清来源：选取正常晚孕妇女4例及妊高征患者13例，其中轻、中、重度妊高征患者各6、2、5例，按全国统编教材《妇产科学》(第4版)［2］中的标准进行诊断和分类。平均孕周为38周，正常晚孕妇女及妊高征患者的年龄、孕龄均无统计学差异。所有孕妇均无心、肝、肾及内分泌病史。未临产时采静脉血，无菌条件下分离血清，-20℃保存待用。 2.细胞培养及分组：脐血管内皮细胞株购自武汉大学典型培养物保藏中心。将细胞加入含10%新生小牛血清的依格尔培养液进行传代培养。实验共分5组，1组加入等量依格尔培养液；2组培养液加入正常晚孕妇女血清；3、4、5组培养液分别加入轻、中、重度妊高征患者血清。2～5组所加孕妇血清体积分数为30%，其他成分与1组相同。 3.观察指标：(1)生长曲线：连续观察7 d，以天数为横轴，以每天所得细胞数为纵轴绘制成图。(2)ICAM-1免疫组织化学染色：免疫组化鼠抗人ICAM-1单克隆抗体购于武汉博士德公司，二氨基联苯胺染色试剂盒购于北京中山生物技术公司。细胞取材后以丙酮固定，依次加入一抗、生物素标记的二抗及辣根酶标记的链霉卵白素，二氨基联苯胺显色封片后镜检。结果按细胞膜或细胞浆染色的深浅来判断：淡棕色为阳性(+)、棕色为中度阳性(+ +)、深棕色为强阳性(+ + +)、无着色的为阴性(-)。(3)内皮细胞凋亡：2、3、4、5组各取培养瓶8个，细胞融合后，换无血清的改良依格尔/F12混合培养基，分别加入各组孕妇血清培养后取材，用碘化丙啶(50 μg/ml，为美国Sigma公司产品)作细胞DNA染色，用流式细胞仪(Facsort，为美国B.D公司产品)检测。分析细胞凋亡：低于G1期DNA含量主峰的记数峰为凋亡峰，以百分比(%)代表细胞凋亡率。 4.统计学方法：采用两样本均数的t检验。
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抗氧化剂和糖皮质激素抑制缺氧／复氧时肾小球血管内皮细胞ICAM-1的表达
细胞间粘附分子-1(Intercellular adhesion molecule-l，ICAM-1)主要在内皮细 胞表达，作为白细胞β2整合素家族的配体在中性粒细胞与内皮细胞紧密结合和随后进入 缺血组织中起重要作用。通过降低ICAM-1的表达会减轻缺血／再灌注损伤，这点已在多个 脏器的动物实验中得到证实。已有研究发现糖皮质激素和抗氧化剂，能降低细胞因子刺激下 升高的ICAM-1，本研究旨在探讨抗氧化剂二硫代氨基甲酸吡 咯烷(pyrrolidine dithiocar bamate，PDTC)和糖皮质激素中的地塞米松(Dexamethasone，Dex)对缺氧／再给氧(hypoxia ／reoxygenation，H／R)条件下对体外肾小球血管内皮细胞ICAM-1表达的影响。1 材料与方法 (1)试剂 纯化抗鼠CD54单克隆抗体(IgG)和FITC标记抗鼠IgG二抗(深圳晶美生物工程有限 公司)，Dex和PDTC(美国SIGMA公司)，RPMI 1640细胞培养基(美国GIBCOBRL公司)，小牛血清 (杭州四季青生物公司)。 (2)细胞培养 小鼠肾小球血管内皮细胞株ESDO由长征医院肾内科提供。复苏后，加入 含20％灭活小牛血清的1640培养液，25 cm细胞培养瓶生长，待1～2 d细胞长满瓶底后，以1 08/L浓度接种传代。细胞存活率用台盼蓝染色判断。 (3)方法 向氧分压可调控的Queue细胞培养箱中注入95％的氮气和5％的CO2混合气体 ,使氧分压为零，为缺氧条件。注入空气和5％CO2混合气体为再给氧。缺氧时间为l0 h， 再给氧时间为6 h，PDTC的浓度为50 μmol/L、5 μmol/L，Dex为l00 μmol/L、1 μmo l /L，分别在缺氧前30 min和再给氧时加入。ICAM-1表达的测定：将生长成单层的内皮细 胞用0．2%EDTA在37℃消化l0 min，PBS洗涤后，调整浓度为108/L。取调整好的细胞悬液l 00 μl,加入CD54单克隆抗体20 μl，混匀后室温避光孵育30 min，加FITC标记IgG二抗2 μl 孵育30 min，PBS洗涤2次，固定。阴性对照以FITC标记的同型抗体代替。24 h内EPICS-XL 型流式细胞仪(美国Coulter公司产品)检测。每个样本分析5000个细胞，结果以阳性细胞的 百分率(％)表示。
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Ang(1-7)对AngⅡ诱导人脐静脉血管内皮细胞株细胞组织因子表达的影响
血管紧张素-(1-7)[Ang(1-7)]是近来新发现的RAS中一重要活性产物.它是在不同酶作用下由Ang Ⅰ和(或)AngⅡ生成的一个由7个氨基酸组成的多肽[1].Ang(1-7)在许多方面与AngⅡ有着相拮抗的作用,如舒张血管、降低血压和抑制细胞增殖等[2],二者共同维持着生理的平衡.
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葫芦素D对血管新生及bFGF诱导PLCγ/Erk1/2通路激活影响
目的:评价葫芦素D对血管内皮细胞增殖、迁移、成管作用的影响及其作用机制.方法:采用人脐静脉血管内皮细胞株(EA.hy926),通过CCK8细胞增殖检测、划痕实验、管腔形成实验检测葫芦素D对血管新生各环节的作用,并通过Western Blot法检测葫芦素D对bFGF介导的细胞信号通路激活的抑制作用.结果:葫芦素D对血管内皮细胞活性影响较低,同时能够明显抑制血管内皮细胞的迁移、成管能力;能够抑制bFGF刺激下FGFR2及其下游信号通路关键蛋白PLCγ、Erk1/2的磷酸化.结论:葫芦素D具有抑制血管新生的作用,其机制可能与抑制bFGF介导的信号通路激活有关.
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双黄连注射液对血管内皮细胞NF-κB信号通道靶分子活性抑制作用的研究
目的:探讨中药复方双黄连注射液对血管内皮细胞作用.方法:用双黄连注射液与人脐静脉血管内皮细胞株(ECV-304)共同培养后,采用MTT法及形态学法观察双黄连注射液对人脐静脉血管内皮细胞的作用及细胞脱氧酶的活性,用Sandwich ELISA法定量分析法和定量免疫细胞技术,检测NF-κB活性及胞浆内IκB含量.
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一种新的来源于人的穿膜肽通过细胞膜屏障和血脑屏障的研究
目的:观察一种新的人体蛋白结构域(Circadian locomoter output cycles kaput protein's DNA-binding peptide, hCLOCK's DNA-BIND)通过细胞膜屏障和血脑屏障的现象.方法:化学合成hCLOCK's DNA-BIND,N端标记FITC荧光素,与培养的血管内皮细胞株(ECV-304)和原代培养的神经胶质细胞孵化后,荧光显微镜下观察并做荧光强度分析.大鼠颈动脉注射hCLOCK's DNA-BIND,做脑冰冻切片,荧光显微镜下观察.结果:hCLOCK's DNA-BIND能够有效通过细胞膜屏障和血脑屏障,内化的量随时间和肽段浓度的增加而增加.结论:hCLOCK's DNA-BIND具有很强的内化作用,这一发现有希望为药物通过细胞膜屏障和血脑屏障提供新的安全有效的载体.
