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17-甲氧基-7-羟基-苯并呋喃查尔酮对心肌细胞内游离钙浓度及L-型钙电流的影响
目的:研究17-甲氧基-7-羟基-苯并呋喃查尔酮(YLSC)对H2O2诱导的心肌细胞内钙超载的拮抗作用及对L型钙电流(ICa-L)的影响.方法:采用SD大鼠乳鼠进行心肌细胞培养,实验分为①正常对照组；②H2O2组:上机前加入终浓度为0.3 mmol·L-1的H2O2;③预先给予低、中、高不同终浓度YLSC药物处理组:分别给予100,200,400 μmol·L-1YLSC的无血清培养基,孵育24 h,上机前加入终浓度为0.3 mmol· L-1H202,以Fluo-3/AM荧光指示剂负载,应用激光共聚焦显微镜技术,分别于加入H202后15 min内检测细胞内[Ca2+]i的变化；分离昆明种小鼠单个心室肌细胞,全细胞膜片钳技术记录YLSC对ICa-L的影响.结果:①与正常对照组比较,H202诱导的模型组细胞内[Ca2+]i增加60.43％±7.75％,而高、中、低YLSC预处理组[Ca2+]i分别增加38.39％±13.87％,14.49％±2.94％,-28.1％ ±1.52％,与模型组比较显著降低(P＜0.01).②YLSC可使心室肌细胞ICa-L的电流-电压(Ⅰ-Ⅴ)关系曲线上移,能改变ICa-L的激活和失活特征,使ICa-L的激活曲线和稳态失活曲线左移.结论:YLSC对心肌细胞钙离子通道有较好的阻断作用,能显著减轻H2O2诱导的心肌细胞内[Ca2+]；超载.
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隔山香正丁醇部位对大鼠胸主动脉的舒张作用及机制的影响
目的:研究隔山香(Lemonfragrant Angelica Root,LAR)正丁醇部位对大鼠胸主动脉环的舒张作用,并探讨其可能的作用机制.方法:采用离体大鼠胸主动脉血管环灌流方法,考察0.34,0.65,1.22 g·L-1隔山香正丁醇部位对氯化钾(KCl)和去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)预收缩的血管环张力的影响.在无Ca2+ Kreb's液中,考察0.34,0.65,1.22 g·L-1隔山香正丁醇部位对氯化钙(CaCl2)量效曲线的影响和NE预收缩的血管环张力的影响.激光共聚焦扫描显微镜检测平滑肌细胞内[Ca2+]i的变化.结果:隔山香正丁醇部位对KC1和NE预收缩的内皮完整和去除内皮血管环均具有浓度依赖性的舒张作用(P＜0.01),并且去除内皮后的舒张作用未受影响;无Ca2条件下,隔山香正丁醇部位能使CaC12,NE预收缩强度显著性降低(P＜0.01).激光共聚焦扫描显微镜下,隔山香正丁醇部位(1.22 g·L-1)能抑制KC1,NE和毒胡萝卜素(thapsigargin,TG)引起的平滑肌细胞内[Ca2+]i升高.结论:隔山香正丁醇部位对大鼠胸主动脉血管有一定的舒张作用,可能通过抑制外钙内流和内钙释放发挥作用.本实验为隔山香水蒸气蒸馏后煎煮入药的成药制备工艺和水溶性药效指标成分的分离提供了依据.
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双歧杆菌LTA、EPS 对小鼠巨噬细胞活力的影响
脂磷壁酸(LTA)和胞外多糖(EPS)是双歧杆菌的细胞壁表面物质,在抗肿瘤和提高免疫力方面已成为研究热点.据此,本研究采用MTT法、荧光显微镜形态观察及激光扫描共聚焦分子生物学观察法检测LTA和EPS对小鼠腹腔巨噬细胞的免疫激活能力,并通过脂多糖(LPS)作用组做对照,进一步探讨LTA和EPS提高免疫活性机理及影响程度.
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大鼠小肠移植排斥反应期移植肠RANTES表达的变化
目的:探讨移植肠RANTES(regulated upon activation,normal T cell expressed and secreted活化T细胞调节的,正常T细胞表达和分泌的因子)的表达在小肠移植急性排斥反应中的意义,以及他克莫司(FK506)对他的影响.方法:选用成年健康♂ SD和Wistar大鼠进行全小肠异位移植.实验分4组,第l组:非手术对照组(Wistar);第2组:同基因移植对照组(Wistar→Wistar);第3组:异基因移植组(SD→Wistar);第4组:FK506治疗组[SD→Wistar+FK506(1 mg/kg-1/d-1,im)].移植术后3,5,7 d取各组大鼠移植肠标本进行病理学检查,并采用免疫荧光染色和激光扫描共聚焦显微镜技术对移植肠RANTES的表达进行连续定量测定.结果:异基因移植组大鼠的移植肠RANTES表达在术后均非常显著高于其他3个对照组(P＜0.01),其动态变化与急性排斥反应的进程呈正相关;FK506治疗组大鼠移植肠RANTES的表达明显低于未治疗组(P＜0.01).结论:RANTES阳性细胞在小肠移植急性排斥反应中发挥了重要作用,动态检测移植肠RANTES的表达变化,可能成为小肠移植急性排斥反应有效的诊断指标之一.
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茉莉花水提物对大鼠胸主动脉的舒张作用及机制
目的 观察中药茉莉花水提物(AEJ)的血管舒张效应并探讨其机制.方法 采用大鼠胸主动脉环灌流,记录张力的变化;激光扫描共聚焦显微镜技术检测血管平滑肌细胞内Ca~(2+)浓度.结果 AKI(0.375～6 g·L~(-1))能够浓度依赖性降低苯肾上腺素(PE,10 μmol·L~(-1))及KCl(60 mmol·L~(-1))引起的主动脉环张力.在无钙环境下,AEJ能抑制高浓度氯化钾(KCl 60mmol·L~(-1))环境下累计加入CaCl_2(0.5～8 mmol·L~(-1))引起的收缩,抑制PE(10 μmol·L~(-1))引起的去内皮主动脉环的短暂收缩(P<0.01).钾通道阻断剂4-氨基吡啶(5 mmol·L~(-1))可显著抑制AEJ的舒血管作用.激光扫描共聚焦检测细胞内Ca~(2+)的结果表明,AEJ浓度依赖性(6,12 g·L~(-1))降低了KCl除极诱导的滑肌细胞胞浆内Ca~(2+)的升高幅度(P<0.05).结论 AEJ能够浓度依赖性舒张大鼠胸主动脉,其作用机制可能是减少Ca~(2+)经电压依赖性钙通道和受体操纵性钙通道流入血管平滑肌细胞及抑制内质网内Ca~(2+)释放有关;电压敏感型K~+通道(K_V)的激活部分参与了AEJ舒血管作用.
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TrkA与snapin蛋白的直接相互作用
目的 确认TrkA与snapin蛋白间的直接相互作用.方法 采用DNA重组技术,构建增强型荧光蛋白表达载体pECFP - TrkAICD(TrkA膜内区)和pEYFP - snapin,共转染HEK 293T细胞后以激光扫描共聚焦显微镜观察并进行荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)分析.结果 成功构建了snapin和TrkA的重组质粒,共转染细胞后激光扫描共聚焦显微镜分析表明两种蛋白分布在细胞质同一层面,荧光共振能量转移(FRET)分析表明能量转移效率＞5％,与对照相比有显著区别(P＜0.05).结论 激光扫描共聚焦及FRET实验结果都证明了TrkA膜内区与snapin两个蛋白之间存在着直接的相互作用.
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M3R介导的cAMP-PKA信号途径对L-型钙通道的调控作用研究
目的 研究M3受体激动剂通过cAMP-PKA信号途径对L-型钙通道的影响.方法 应用全细胞膜片钳技术记录M3受体激动剂胆碱对大鼠单个心室肌细胞L-型钙通道电流(ICa-L)的影响;采用激光扫描共聚焦技术观察细胞内钙离子的变化.结果 胆碱使大鼠心室肌细胞ICa-L密度从(9.07±0.68)pA/pF减少至(5.58 ±0.62)pA/pF(n=4,与对照组相比,P＜0.01),H89加胆碱组使ICa-L电流密度减少至(7.68±0.75),幅度明显高于胆碱组(n=4,与胆碱组相比,P＜0.01).胆碱抑制KCl除极诱导的心肌细胞[Ca2+]i的升高,从(2.83±0.08)降至(1.17±0.09)FI/FI0(n=30,与KCl组相比,P＜0.01),胆碱与H89组可使[Ca2+]i降至(1.65±0.17)FI/FI0,幅度高于胆碱组(n=30,与胆碱组相比,P＜0.05).结论 M3受体激动剂胆碱通过抑制PKA活性调控L-型钙通道,使外钙内流减少,降低细胞[Ca2+]i,从而发挥抗心肌保护作用.
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M3受体激动剂胆碱对大鼠心肌细胞内钙离子的影响
目的 研究M3受体激动剂胆碱对大鼠心肌细胞内钙离子的影响.方法 采用钙荧光染料 Fluo-3/AM负载心肌细胞,在激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)上测定细胞[Ca2+]i的变化.结果 胆碱不影响静息状态下的细胞[Ca2+]i,对咖啡因和三磷酸肌醇(IP3)介导的细胞内钙的释放均无作用.5.0 mmol/L 胆碱可以抑制KCl除极诱导的心肌[Ca2+]i的升高幅度,2.0 nmol/L 4-DAMP可以阻断这一作用.结论 M3受体激动剂胆碱通过阻断心肌细胞膜电压依赖性钙通道降低心肌细胞[Ca2+]i,从而发挥心肌保护作用.
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激光扫描共聚焦显微技术及其在神经、肿瘤相关研究中的应用
介绍了近年来新出现的共聚焦显微镜新的种类,如传统激光共聚焦和活细胞激光共聚焦,对其功能及在神经、肿瘤研究中的应用进行了综述,使现代显微镜能够更加深入研究和分析细胞的变化过程和结构.活细胞激光扫描共聚焦显微镜与双光子激光扫描共聚焦显微镜实现了对肿瘤、神经活细胞长时间地动态观测,可更加真实地揭示细胞凋亡的机制与规律.
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细胞间缝隙连接通讯改变在神经系统疾病中的应用
细胞间缝隙连接通讯(gap junctional intercellular communication,GJIC)概念的提出已达40年,随着划痕标记染料示踪(scrape-loading and dye transfer,SLDT)技术和激光扫描共聚焦显微镜下荧光淬灭后恢复(fluorescence redistribution after photobleacing,FRAP)技术的创立,使得近10余年来各学科关于细胞间缝隙连接通讯的研究快速发展,业已成为生命科学的研究热点之一.
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创伤后应激障碍大鼠海马星形胶质细胞Bax的表达
①目的观察创伤后应激障碍（PTSD）大鼠海马星形胶质细胞凋亡相关蛋白（Bax）的表达。②方法选用 Wistar大鼠，随机分为对照组和模型组，使用单一连续应激（SPS）建立 PTSD大鼠模型，采用激光共聚焦方法观察神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）与 Bax在海马星形胶质细胞中的共存。③结果模型组大鼠海马星形胶质细胞 GFAP、Bax阳性细胞数和积分光密度均高于对照组（P＜0．05）。④结论 PTSD大鼠海马组织星形胶质细胞Bax表达增加，这可能与PTSD发病机制有关。
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心肌细胞内钙火花的动力学研究
2001年王世强等人把膜片钳技术和激光扫描共聚焦显微成像技术结合起来,首次记录到心肌细胞内由单个L型钙通道分子产生的局部钙信号,将其命名为Ca2+sparklet(钙星).实验结果证明单个钙通道开启所形成的钙星可触发单个钙火花,参与钙致钙释放的L型钙通道和RyR相距仅12～15纳米.
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穿孔素在溃疡性结肠炎患者肠黏膜的表达及意义
本研究利用激光扫描共聚焦显微镜技术,对溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)患者肠黏膜中穿孔素的表达进行检测,以期有助于阐明穿孔素介导的细胞毒机制是否在UC发病中起作用.材料与方法一、研究对象从19例UC患者病变肠黏膜及12例结肠癌患者手术标本正常肠段各取一块活检标本,放人液氮中速冻20 s后取出,-75℃冰箱贮存备用.
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M3受体激动剂对豚鼠心室肌细胞L型钙通道的影响
目的 研究M3受体激动剂胆碱对豚鼠心室肌细胞L型钙通道的影响.方法 应用全细胞膜片钳技术记录M3受体激动剂胆碱对豚鼠单个心室肌细胞L型钙通道电流(ICa-L)的影响;采用激光扫描共聚焦技术观察细胞内钙离子的变化.结果 应用10 mmol·L-1胆碱使豚鼠心室肌细胞ICa-L密度从(9.02±0.82) pA/pF减少到(5.61±0.55) pA/pF(n=4,P<0.01),5 nmol·L-1 4-DAMP能够使其恢复至 (8.12 ±0.65) pA/pF(n=4,P＜0.01);10 mmol·L-1胆碱抑制 KCl除极诱导的心肌细胞内钙的升高,从(2.76±0.05)降至(1.37 ±0.05)倍(n=8,P<0.01), 5 nmol·L-1 4-DAMP可以阻断该作用 (n=8,P<0.01).结论 M3受体激动剂胆碱通过延长L型钙通道激活过程而明显抑制ICa-L,减少细胞外的钙离子内流,降低心肌细胞内钙,从而发挥抗心律失常作用.
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枳壳醇提物对大鼠离体胸主动脉环的收缩作用与机制
目的 探讨枳壳醇提物(FAE)对大鼠离体胸主动脉的收缩作用与机制.方法 制备Wistar大鼠胸主动脉环,采用离体血管实验方法,经生物信号采集与分析系统测定血管环张力的变化.结果 FAE能够浓度依赖性的提高主动脉环张力,对去除内皮血管环的大收缩幅度为(74±4.9)%,明显强于对内皮完整血管环的作用(44±3.4)%(P<0.01).预孵一氧化氮合酶抑制剂L-NAME(300 mmol·L-1)后,FAE对内皮完整的血管环的大收缩幅度明显提高,达到(77±5.3)%(P<0.01).在去除内皮的血管环上,维拉帕米(10-5 mol·L-1,VER)及无钙液孵育均可明显阻断FAE的收缩作用,其大收缩幅度分别降低(52±3.8)%和(49±3.7)% (P<0.01);激光扫描共聚焦检测细胞内钙的结果表明,FAE浓度依赖性(0.16、0.32 g·L-1)的增加静息状态平滑肌细胞胞质内钙浓度.结论 FAE能够浓度依赖性收缩大鼠胸主动脉,其作用机制可能与激活血管平滑肌上的电压依赖性钙通道,促使胞外Ca2+内流有关;同时,FAE也作用于血管内皮细胞,促进一氧化氮的释放,部分抵消其缩血管作用.
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M3 受体激动剂对慢性心衰大鼠心肌ICa-L及[Ca2+]i的影响
目的 研究M3 受体激动剂胆碱( choline)对慢性心力衰竭( CHF)大鼠心肌的保护作用及可能的机制. 方法CHF大鼠Ⅱ型胶原酶消化分离单个心肌细胞,全细胞膜片钳技术记录L-型钙电流( ICa-L )变化;激光扫描共聚焦技术观测细胞内钙([Ca2+]i)变化. 结果 膜片钳实验结果显示,与CHF组比较,choline组ICa-L电流密度明显增高( n=6,P<0. 01);预敷U73122后加入choline,与choline组比较, ICa-L电流密度明显下降(n=6,P<0. 01). 共聚焦实验结果显示,与CHF组比较,choline组[ Ca2+] i 明显升高( n=80,P<0. 01);与 choline 组比较,U73122 与 choline 共同孵育组[Ca2+]i 升高幅度不明显(n=80, P<0. 01). 预先给予4-DAMP可部分逆转choline升高ICa-L及[ Ca2+] i 的作用. 结论 M3 受体对CHF大鼠的心肌保护作用可能是通过Gq/11-PLC途径开放L-型钙通道,促进Ca2+内流,使[ Ca2+] i 增加.
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钠离子通道阻滞剂对软骨细胞骨架的影响
骨关节炎(OA)是一种引起关节慢性疼痛的疾病,其发病机制尚不明确,关节软骨的退行性变是OA的特征之一.我们采用钠离子通道阻滞剂利多卡因作用于正常原代软骨细胞并采用激光扫描共聚焦显微镜观察其细胞骨架,并观察软骨细胞钠离子通道被阻滞后是否会引起细胞骨架形态学变化,探讨关节软骨退变机制.
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茉莉花提取物的舒血管作用
目的：观察中药茉莉花提取物(EJs)对大鼠离体胸主动脉环的舒血管作用并探讨其作用机制。方法采用离体血管环灌流装置,观察 EJs 对苯肾上腺素(PE)或氯化钾(KCl)预收缩血管的影响。检测左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME)和氯化钡(BaCl2),格列本脲(Gli)对0.5,1,2,4,8 g·L-1 EJs 舒血管作用的影响；观察 EJs 对氯化钙(CaCl2)及 PE在无钙液中收缩影响；激光扫描共聚焦显微镜技术检测血管平滑肌细胞内钙浓度。结果在内皮完整血管上,EJs 依赖性地降低 PE 或 KCl 预收缩血管的张力,大舒张幅度分别为(105.0±3.2)%,(78.0±6.5)%； L-NAME 明显削弱对 EJs的舒血管作用(P<0.01),大舒张幅度为(58.0±6.9)%；BaCl2,Gli 均能明显削弱 EJs 的舒血管作用(P <0.01),大舒张幅度分别为(37.0±5.2)%,(78.0±10.0)%；在无钙环境下,EJs 能抑制 PE 引起去内皮主动脉环短暂收缩(P <0.01),大收缩幅度(70.0±6.3)%,EJs 能抑制0.5~8 mmol·L-1 CaCl2引起的收缩(P <0.01),血管收缩幅度降低(65.0±3.2)%。4,8 g·L-1 Ejs 钙 Fmax / F0分别为(2.0±0.2)和(1.5±0.2)。结论 EJs 能够浓度依赖性舒张大鼠胸主动脉,其作用机制可能与促进一氧化氮释放、激活多个 K+通道,减少细胞内钙离子浓度有关。
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FGF-2在心肌细胞钙离子调节作用的研究
目的:观察FGF-2对心肌细胞的[Ca2+]i是否有调节作用,并对FGF-2在心肌细胞促生长作用中的钙信号转导机制进行了初步的研究.方法:选择狗胚心肌细胞系作为研究模型,观察1、10、100和1 000 ng/mL重组FGF-2对细胞生长和细胞内钙离子的影响.细胞在含不同浓度FGF-2低血清培养基中生长5 d,测定细胞数量和分裂指数作为FGF-2对细胞生长的影响.细胞以Fluo-3/AM负载作为细胞内钙离子的指示剂,用激光扫描共聚焦显微镜观察细胞内钙离子含量的变化,不同浓度FGF-2作用后的1、4和8 h时的细胞内钙离子含量的相对变化以Fluo-3荧光强度的变化作为指标.以连续扫描的方式,观察15 min之内细胞内钙离子动力曲线的变化,以反应FGF-2对细胞钙离子作用的短时效应.结果:1、10、100 ng/mL重组FGF-2可以促使培养的心肌细胞系细胞的增殖和分裂,1 000 ng/mL FGF-2则产生明显的抑制作用.该心肌细胞系细胞的Fluo-3/AM染色显示,静息时的细胞内钙离子浓度是很低的,FGF-2刺激后Fluo-3荧光染色明显上升,并呈现出不均一性,以细胞核区的深染为特点.细胞内钙动力曲线显示,1、10、100 ng/mL FGF-2可引起细胞内钙离子缓慢而持续的上升,1 ng/mL FGF-2组这种现象持续到4 h后消失,而10和100 ng/mL FGF-2组则持续到8 h后才逐渐下降接近正常水平.1 000 ng/mL FGF-2对细胞内钙离子的调节作用是双向的,在所观察的15 min之内,FGF-2使细胞内钙离子浓度下降,此后的1 h后开始上升,至8 h后还明显高于对照.结论:FGF-2对体外培养的心肌细胞系细胞的生长和对细胞内钙离子的影响具有双向性,并且这种促生长作用的剂量与促细胞[Ca2+]i的剂量是相平行的.对细胞内钙离子的调控,可能是FGF-2在心肌细胞中发挥其生物效应的一个重要途径.
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参麦注射液对急性缺氧-复氧心肌细胞凋亡的影响
目的:观察参麦注射液对急性缺氧-复氧后心肌细胞凋亡的影响,并探讨其可能机制.方法:采用出生3天的Wastar大鼠,原代培养心肌细胞.实验分为3组:(1)正常组:心肌细胞不做任何处理,按正常条件培养(含10%胎牛血清的低糖DMEN培养液,青霉素100U/L,链霉素100 mg/L,37℃、5%CO2、91%湿度环境培养).(2)缺氧-复氧组:将心肌细胞进行缺氧-复氧处理.(3)参麦注射液组:心肌细胞复氧同时加入5 mL/L(1g/L)参麦注射液15 min.模型使用化学缺氧法,将Na2S2O4加入无糖、无氧的D-Hank's液中,制成缺氧溶液(pH 7.0-7.4),替换正常培养液使心肌细胞缺氧5min,再将缺氧液换成正常含血清培养液孵育15 min模拟再给氧,复制心肌细胞急性缺氧-复氧(anoxia-reoxygenation,A/R)模型.然后以Annexin V-FITC/PI双染色法,用流式细胞仪检测细胞早期凋亡百分率;激光扫描共聚焦显微镜观察Fluo-3负载的心肌细胞内钙离子水平的变化.
