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糖尿病大鼠视网膜血管铺片中碱性成纤维细胞生长因子的表达与血管超微结构的改变
糖尿病视网膜病变 (diabetic retinopathy,DR) 是以新生血管形成为主要病理改变的疾病.目前已公认这种新生血管形成与生长因子相关.笔者的前期研究结果也证明DR与血管内皮生长因子[1](vascular endothelial growth factor,VEGF)及碱性成纤维细胞生长因子[2](basic-fibroblast growth factor,bFGF)有相关性,但生长因子与血管本身病变的关系如何,尚未见报道.笔者采用链脲佐菌素(streptozocin,STZ)诱导的糖尿病大鼠动物模型,进行了bFGF与视网膜血管超微结构关系的研究,现分析报告如下.
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视网膜血管铺片技术的改进
目的：探讨视网膜血管铺片技术的改进及在实验动物小鼠，大鼠，狗和猴中的应用。方法应用蛋白酶 K －胰蛋白酶联合消化法制备视网膜血管铺片，行 HE 及 PAS 染色观察血管形态，免疫组化方法观察 CD31及VEGF 的表达。结果用改进方法制备的视网膜血管铺片，血管网完整，无神经组织残留，可清晰显示血管走向。各级血管形态清晰，血管分支清楚完整，无断裂现象。血管内皮细胞形态清晰。 CD31在血管周细胞及内皮细胞均有表达；VEGF 主要在内皮细胞表达。结论改进的视网膜血管铺片技术可成功应用于不同实验动物，为视网膜血管性疾病的研究提供了重要途径。
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糖尿病视网膜病变中血管内皮细胞生长因子与血管病变的关系
目的:研究糖尿病大鼠视网膜病变(DR)时血管内皮细胞生长因子(VEGF)与血管器质性改变的关系.方法:建立糖尿病大鼠模型,随机分为正常对照组(M)及糖尿病1月组(M1)、3月组(M3)、5月组(M5).分别在视网膜血管铺片上行VEGF原位杂交、免疫组化,并分别对视网膜血管进行透射电镜观察.结果:①周细胞数量M1组与M组相比无差别(P＞0.05),M3及M5组与M组相比明显减少(分别P＜0.01,P＜0.001);②毛细血管形态以M5组病变重,可见毛细血管栓塞,无细胞毛细血管;③VEGF原位杂交仅M5组表达为34%;④VEGF免疫组化仅M5组有表达,为56%;⑤血管的透射电镜观察M组未见异常改变,从M1组开始出现异常改变,以M5组明显.表现为基底膜节段性增厚、断裂缺失,内皮细胞肿胀变形,向管腔内指状突起,异染色质浓集居边,周细胞核异染色质浓集居边,线粒体肿胀变性,甚至呈空泡状.结论:DR时血管器质性改变在先,而生长因子表达在后.
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固定时间不同的大鼠视网膜血管铺片酶消化技术改进研究
目的 探索固定时间不同的大鼠视网膜铺片酶消化方法和消化时间,提高大鼠视网膜铺片质量.方法 正常SD大鼠12只,颈椎脱臼法处死后,摘取眼球,随机分3组于4%甲醛溶液中固定2天、3个月及7个月.将固定好的眼球取出,分离视网膜,每例视网膜再随机分为2份,分别行常规胰蛋白酶消化和改进后的蛋白酶K-胰蛋白酶联合消化.消化完全后制备视网膜血管铺片,HE染色,显微镜下观察各级血管形态,直到获得清晰的血管图像为止.结果 固定2天、3个月及7个月的大鼠视网膜常规胰蛋白酶消化法所用时间分别为:3%的胰酶消化液10 h、6%的胰酶消化液22 h、9%的胰酶消化液28 h.蛋白酶K-胰蛋白酶联合消化法所用时间分别为:0.1%的蛋白酶K消化15 min,3%胰蛋白酶消化5 h;0.1%的蛋白酶K消化15 min,6%胰蛋白酶消化7 h;0.1%的蛋白酶K消化20 min,9%胰蛋白酶消化20 h.固定2天、3个月的视网膜在两种消化方法中,成片效果基本相同,血管网铺片完整,各级血管形态、走向清晰,无断裂,血管内皮细胞形态及细胞核均清晰显示,但联合消化法消化的更为彻底几乎无其他组织残留.固定7个月的视网膜,采用单纯胰蛋白酶消化的,存在血管断裂现象,而采用联合消化法的视网膜血管断裂现象优于前者.结论 改进后的蛋白酶K-胰蛋白酶联合消化法,优于常规胰蛋白酶消化法,对长时间固定的视网膜消化稳定性较好.
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超声波提高大鼠视网膜血管消化铺片的效率
目的 将超声波应用于大鼠视网膜血管消化铺片技术,提高糖尿病视网膜病变的形态学研究质量.方法 取SD大鼠25只,尾静脉注射55 mg·kg-1链脲佐菌素制作Ⅰ型大鼠糖尿病模型,随机均分2组,胰蛋白酶机械振荡消化组(每隔20 min使用摇床振荡2 min)和超声波(16.5 kHz)辅助胰蛋白酶振荡消化组,分别制作视网膜血管消化铺片,PAS常规染色,比较铺片成功率和光镜观察铺片形态学.结果 8周后,将血糖值稳定于16.7 mmol·L-以上的20只SD大鼠纳入研究,超声波辅助胰蛋白酶振荡消化法比胰蛋白酶机械振荡消化法的铺片成功率高(分别为85％和55％,P＜0.05).在理想的全视网膜血管铺片上可发现典型的形态学变化,如周细胞核固缩和无细胞毛细血管.结论 超声波辅助胰蛋白酶制作视网膜血管消化铺片成功率高且简单有效.
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碱性成纤维细胞生长因子在糖尿病大鼠视网膜血管中的表达
目的通过糖尿病大鼠视网膜血管铺片的原位杂交及免疫组化,直接证明视网膜血管中碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)蛋白质及mRNA的表达,并探讨bFGF在糖尿病视网膜病变(DR)发展过程中的作用.方法复制链脲佐菌素(sTZ)糖尿病大鼠动物模型,取不同组、不同时期大鼠视网膜的血管进行铺片,并在铺片上进行免疫组化及原位杂交,检测铺片的血管上bFGF蛋白质及mRNA的表达情况.结果(1)正常对照组(M)、血糖恢复组及糖尿病1个月组(M1)大鼠视网膜血管的形态及周细胞数均无明显差异,bFGF蛋白质及mRNA均无阳性表达.(2)糖尿病3个月组(M3)血管周细胞数减少(P＜0.01),细胞核可见bFGF mRNA表达(78%),血管壁可见bFGF蛋白表达阳性(56%).(3)糖尿病5个月组(M5)血管周细胞数减少(P＜0.01)且可见闭塞毛细血管及血栓,细胞核bFGF mRNA表达阳性率高于M3为89%,血管壁bFGF蛋白质表达也高于M3为89%.结论 bFGF在STZ大鼠的视网膜血管中有表达,且随着病程的延长其表达加强.
关键词： 碱性成纤维细胞生长因子 视网膜血管铺片 原位杂交 免疫组化 糖尿病视网膜病变 -
糖尿病大鼠视网膜血管铺片技术的改进及运用
目的:视网膜铺片技术难度较大,往往不易制出各实验组均一的、理想的视网膜微血管铺片.我们对原有方法在消化技巧、消化时间、展片等方面进行了改进并取得较好效果.方法:1.模型建立:6m糖尿病模型,180～200g雄性W istar大鼠60只,随机分成糖尿病组,糖尿病治疗1、2、3、4组,正常对照组, 每组10只,实验组经尾静脉注射链脲佐菌素(Streptozocin STZ)50m g/kg,正常对照组注射生理盐水.定期测血糖、尿糖及体重.2.取材固定:颈动脉取血,取双侧眼球固定于4%多聚甲醛液中48hr.3.消化:沿距齿缘剪开眼球去除晶状体,用蒸馏水漂洗数次.以视神经乳头为中心将眼球壁均匀地剪成三等份,剥离眼球壁视网膜层,用甘胺酸缓冲液浸泡24hr 4℃.每组再分为振荡消化组和常规消化组.将剥离出的视网膜分别放入10Lm 3%胰酶液中,37℃进行消化.振荡消化组:间隔20m in摇晃一次;常规消化组:静止消化.两组均分别消化2、2.5、3hr三个时相.4 .铺片:用吸管将半透明状的血管网移入蒸馏水中漂洗数次,用吸管轻吹打非透明状区域, 将吹打成透明状的血管网取放在载玻片上,展平,自然干燥.5.染色:shciff试剂染色20min,10%偏重亚硫酸钠液洗3次,每次洗5min.Mayrr氏苏木素染 2min,冲洗5min,脱水、透明、封片.结果:振荡消化组:2、2.5、3hr各实验组均获得消化程度均匀一致、无残存的视网膜各层细胞,血管形态结构清晰,染色艳丽的视网膜血管铺片.可清楚观察血管的行走、管径的变化、内皮细胞及周细胞的比例等.常规消化组:2、2.5、3hr消化,经吹打后仍有多少不等残存的视网膜各层细胞,各组均未完整显示出视网膜血管.讨论:DR的发病机制迄今尚不十分清楚,长期高血糖是发病的基础.主要病理形态改变是微血管闭塞和微血管瘤形成.这些改变用光镜和电镜切片技术难以观察.视网膜铺片技术已在实验研究中运用多年,但由于其技术操作较难,步骤较繁锁 ,特别是大量成批的动物实验时很难制出均一、理想的铺片,严重影响了对实验结果的分析 .本实验对该方法的改进,为探讨DR发病机理及早期防治提供了新的技术手段.
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视网膜血管铺片技术的改进及在糖尿病视网膜病研究中的运用
目的:改进视网膜血管铺片的制备方法,并用于糖尿病视网膜病的研究.方法:分别用胰蛋白酶消化法及胃蛋白酶-胰蛋白酶联合消化法制备视网膜血管铺片,比较铺片成功率.一次性腹腔注射STZ诱导糖尿病大鼠模型,成模13wk时以胃蛋白酶-胰蛋白酶联合消化法制备视网膜血管铺片,行HE染色观察血管形态改变,免疫组织化学染色方法观察RAGE、ICAM-1的表达.结果:胃蛋白酶-胰蛋白酶联合消化法较胰蛋白酶消化组铺片成功率高(80%vs53.3%,P＜0.05),能显示清晰、完整的视网膜血管网.糖尿病大鼠视网膜无细胞毛细血管较正常大鼠增加2.67倍,毛细血管RAGE及ICAM-1免疫活性分别上调1.26倍,1.43倍(P＜0.001).结论:胃蛋白酶-胰蛋白酶联合消化法是一种稳定的重复性好的视网膜血管铺片技术,可用于糖尿病视网膜病变的研究.
关键词： 视网膜血管铺片 糖尿病视网膜病 胰蛋白酶消化 胃蛋白酶-胰蛋白酶消化
