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单纯疱疹病毒Ⅱ型G蛋白免疫优势肽段在杆状病毒表达系统的表达及其反应原性
目的 利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统对单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)糖蛋白G(gG-2)免疫优势片段gG321-580进行表达,纯化并评价其反应原性,以探索HSV-2免疫诊断试剂的研制.方法 提取HSV-2 DNA作为模板,PCR扩增gG321-580基因,克隆至pFastBac HTC载体中,通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达His-gG321-580融合蛋白,SDS-PAGE和Western-blotting鉴定表达产物,NTA-Ni2+纯化后间接ELISA评价其反应原性.结果 HSV-2 gG321-580在昆虫细胞Sf9中得到特异性表达,纯化后的重组gG321-580蛋白对HSV-2阳性血清抗体有较好的抗原性和特异性.结论 gG321-580蛋白在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中成功表达,表达产物表现出良好的反应原性,为发展HSV-2免疫诊断试剂奠定了基础.
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利用昆虫杆状病毒载体表达人碱性成纤维细胞生长因子
目的 利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,将人碱性成纤维细胞生长因子(human basic fibroblast growth factor,hbFGF)基因进行表达,并检测重组蛋白的特异性及生物学活性.方法 将人bFGF的cDNA克隆至杆状病毒转座载体pFastBacHTb中,并转化到含穿梭载体Bacmid的感受态细菌DH10Bac中,获得重组Bacmid/bFGF;纯化DNA后,转染昆虫细胞Sf21,PCR鉴定重组病毒;进一步将重组病毒感染Sf21细胞,在Sf21细胞中进行表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳、Western bloting分析;MTT法检测表达产物的生物活性.结果 重组Bacmid/bFGF DNA直接转染昆虫细胞得到重组病毒rAcV-Bac-bFGF,病毒滴度MOI值≈8.重组病毒在感染后48 h开始出现一相对分子质量为23 000大小的特异带,感染后72 h蛋白量明显增加,96 h蛋白量达到大,120 h蛋白量开始减少.在正常昆虫Sf21细胞的对照中未见该蛋白带.Western bloting显示目的蛋白条带与人bFGF抗体发生特异反应.MTT结果显示重组蛋白能明显促进3T3细胞的分裂增殖.结论 利用杆状病毒表达系统可成功表达具有生物学活性的bFGF蛋白.
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日本血吸虫SjPP基因重组杆状病毒的构建和在昆虫细胞中的表达
目的 在昆虫细胞中表达获得可溶性的日本血吸虫SjPP重组蛋白.方法 提取日本血吸虫成虫总RNA,通过RT-PCR扩增出SjPP基因的编码区序列,将其定向克隆到供体质粒pFastBac HT-B中,构建重组杆状病毒供体质粒pFastBac-SjPP,转化人大肠埃希菌DH10Bac进行转座,提取重组杆粒Bacmid-SjPP,用阳离子脂质体法转染粉纹夜蛾(TN5B1-4)细胞.利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白表达情况.结果 构建了含日本血吸虫SjPP基因的重组杆粒Bacmid-SjPP,转染TN5B1-4细胞后,获得有感染力的重组杆状病毒,并在TN581-4细胞中成功表达SjPP蛋白.该重组蛋白可被抗SjPP蛋白的兔血清识别.结论 成功构建SjPP基因重组杆状病毒,并在TN581-4细胞中表达,该蛋白具有良好的抗原性.
关键词： 日本血吸虫 SjPP Bac-to-Bac杆状病毒表达系统 -
2型单纯疱疹病毒糖蛋白G基因片段的表达及其抗原性分析
目的 获得单纯疱疹病毒2型(HSV-2)糖蛋白G(gG2)免疫优势片段gG321-580并初步研究其抗原性.方法 PCR扩增gG321-580基因,利用Bac-to-Bac表达系统表达gG321-580His融合蛋白,Western blot和间接ELISA鉴定蛋白活性.结果 在Sf9细胞中成功表达HSV-2 gG321-580His蛋白,gG321-580His能与小鼠抗HSV-2 gG2单抗结合,在60 KDa附近出现特异性结合条带,ELISA分析初步证实gG321-580His能够与HSV-2阳性血清反应,而不与HSV-1阳性血清和正常人血清反应.结论 gG321-580His蛋白获得成功表达,ELISA检测显示其具有良好的抗原性,为研究以gG321-580蛋白作为靶区域的HSV-2型特异性诊断试剂盒打下实验基础.
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应用bac-to-bac杆状病毒表达系统在sf9昆虫细胞中重组表达保守性多巴胺能神经营养因子蛋白
保守性多巴胺能神经营养因子(CDNF)是一类新型神经营养因子,可能对帕金森病(PD)具有一定的治疗作用[1-2].我们通过bac-to-bac杆状病毒表达系统,在sf9昆虫细胞中成功诱导表达出重组CDNF蛋白.
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Ⅱ型单纯疱疹病毒糖蛋白D在杆状病毒表达系统中的表达、纯化及免疫效果评价
目的 利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统对Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-2)糖蛋白D(gD2)进行表达,纯化后评价其免疫效果,以探索HSV-2重组亚单位疫苗的研制.方法 提取HSV-2 DNA作为模板,用聚合酶链式反应(PCR)扩增gD2基因,克隆至pFastBac HTA载体中,利用载体中的His基因标记gD2,通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达His-gD2融合蛋白,表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot检验,用镍柱进行纯化,免疫小鼠评价其免疫原性.结果 HSV-2 gD2在昆虫细胞Sf9中得到特异性表达,纯化后的重组蛋白诱导小鼠体内产生高水平的IgG抗体及中和抗体.结论 gD2基因在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中获得表达,表达产物表现出良好的免疫原性及中和活性,为发展HSV-2亚单位疫苗奠定了基础.
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HPV6晚期表达基因L1的克隆并在杆状病毒表达系统的表达及其抗血清制备
目的获得具有正确序列的人乳头瘤病毒HPV6型晚期表达基因L1,并获得其高活性表达L1基因特异性抗血清,为进一步研究及临床检验应用奠定物质基础.方法用PCR法从感染人乳头瘤病毒患者尖锐湿疣组织中获得HPV6晚期表达基因L1,测序验证后,将正确的HPV6晚期表达基因L1序列,插入Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,转染昆虫细胞Sf9,表达外壳蛋白L1,并以之作为抗原免疫兔,获得特异性抗血清.结果获得了正确序列HPV6晚期表达基因L1,在Bac-to-Bac杆状病毒系统活性表达并获得其特异性抗血清.结论获得HPV6晚期表达基因L1,及有抗原活性的表达和相应抗血清.
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血管生长抑制因子基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达
目的:获得具有高活性的Angiostatin表达,为进一步研究及应用奠定物质基础.方法:用PCR法从人纤维蛋白酶原plasminogen基因中,获得Angiostatin(kringle1-4)基因,测序验证后,将正确的Angiostatin(K1-4)序列,插入Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,转染昆虫细胞sf9,表达Angiostatin.结果:获得了正确序列Angiostatin cDNA,并在Bac-to-Bac杆状病毒系统表达.结论:获得有抑制活性的Angiostatin表达.
