首页 > 文献资料
-
siRNA干扰HSV1 gD糖蛋白基因的研究
以HSV1 gD糖蛋白基因为靶点,设计合成5对siRNA,并构建pEGFP-N1-gD融合表达质粒,脂质体法共转染Vero细胞,利用绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的特征,流式细胞仪筛选特异沉默gD表达的siRNA.然后有效siRNA转染Vero细胞并感染HSV1,通过空斑减数实验,Real-time PCR和子代病毒滴度评价其对HSV-1感染的作用.结果显示siRNA能有效抑制gD-EGFP融合蛋白和感染细胞内gD糖蛋白的表达,但对HSV-1的感染性无明显抑制作用,故选择gD作为siRNA抗病毒靶点还需进一步的论证.
-
单纯疱疹病毒糖蛋白D的表达及免疫学鉴定
单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)是TORCH综合征的病原体之一.新生儿可通过宫内、产道和出生后等多种途径感染,大部分患儿呈现症状,如皮炎、角膜炎、口唇疱疹,也可发生涉及多个器官的播散性感染,严重者出现疱疹性脑膜炎,并常导致婴幼儿死亡.目前尚无全身用的特效药物和有效的防范措施.HSV包膜糖蛋白D(glycoprotein D,gD)是极为保守的免疫原性蛋白,在体内可诱导高滴度的中和抗体,因此gD基因成为近些年来诊断研究的靶基因.本文尝试将gD蛋白在酵母菌中表达,并分析其抗原性,为建立快速易行的重组抗原诊断试剂盒奠定基础.此外,利用该表达系统表达的HSV gD蛋白,可为HSV基因工程重组疫苗的研制提供依据,对优生优育、提高人口出生质量具有重要的理论及实际意义.
-
白细胞介素-2基因佐剂对单纯疱疹病毒糖蛋白D DNA疫苗的免疫增强作用
目的探讨白细胞介素-2(IL-2)基因佐剂对单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-Ⅰ)糖蛋白D(gD)DNA疫苗的免疫调节作用.方法将表达HSV-Ⅰ gD基因的DNA疫苗质粒IRES-gD 以及HSV-Ⅰ gD与IL-2 基因共表达的重组质粒IRES-gD-IL-2分别注入BALB/c 鼠股四头肌,检测特异性抗体和中和抗体的产生情况,并于第3次注射后14 d用滴度100组织培养半数感染量(TCID50)的HSV-1病毒感染小鼠,观察小鼠的生存情况.结果 IRES-gD 组和IRES-gD-IL-2组均可刺激小鼠产生抗HSV-Ⅰ gD 的特异性抗体和中和抗体,抗体滴度随免疫次数增加而升高,IRES-gD-IL-2组小鼠产生的抗体及中和抗体滴度明显高于IRES-gD 组,两组小鼠的生存率差异无统计学意义 .结论 IL-2基因佐剂可促进HSV-Ⅰ gD DNA 疫苗诱导抗体的产生,并具有免疫增强作用.
-
单纯疱疹病毒I型糖蛋白D核酸疫苗的构建及初步研究
目的构建、制备I型单纯疱疹病毒糖蛋白D重组质粒DNA疫苗,初步检测其诱导机体产生体液免疫应答的效果,为研制HSV-1新型疫苗奠定基础.方法用PCR的方法从HSV-1病毒基因组中扩增糖蛋白D(glycoprotein D,gD)基因,利用基因重组技术构建重组质粒;将重组质粒体外转染真核细胞COS-7,Westernblotting检测表达产物;于BALB/C小鼠后腿胫前肌注射免疫,0、2周各免疫1次,100μg/次.初次免疫后0、2、4、6周眼眶采血,ELISA间接法检测抗体.结果重组质粒酶切出相应大小片段,经测序证实为HSV-1gD序列.Western blotting证实能够在体外真核细胞中表达.免疫小鼠后,产生特异性抗体,抗体滴度1:2000.结论HSV-1gD重组质粒DNA有可能作为HSV-1的DNA疫苗,用于防治HSV-1感染及其相关疾病.
-
HSV-2DNA疫苗诱导小鼠免疫应答研究
目的探讨含有单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)糖蛋白D全基因序列的重组质粒作为DNA疫苗的可能性.方法采用PCR方法获得HSV-2gD片段,构建含HSV-gD片段的重组质粒pcDNA3-gD.重组质粒作为DNA疫苗免疫小鼠,观察其对小鼠免疫效果及保护作用.结果重组质粒pcCDNA3-gD免疫小鼠后可产生特异性抗体,可保护小鼠免受HSV-2的致死性攻击,存活率达75%.结论重组质粒pcDNA3-gD可诱导小鼠产生特异性免疫反应,可以作为HSV的候选DNA疫苗.
-
HSV-2糖蛋白D在昆虫-杆状病毒表达系统中的表达及免疫原性分析
目的:在昆虫细胞中表达2型单纯疱疹病毒(HSV-2)糖蛋白D(gD2)胞外区基因,检测其免疫原性.方法:以HSV-2病毒基因组为模板,PCR扩增得到gD2片段,构建至杆状病毒质粒Bacmind中,转染sf9细胞,包装重组杆状病毒,收集后连续感染sf9细胞,收获第4代重组杆状病毒(P4),通过Western blotting法鉴定蛋白表达情况,采用空斑实验检测重组病毒滴度,将P4代重组病毒作为种子大量感染sf9细胞,上清经镍柱亲和层析进行纯化,将纯化后的蛋白在第0、2和4周免疫BALB/c小鼠(gD2组),以PBS作为阴性对照(PBS组),ELISA检测小鼠血清中gD2特异性IgG滴度.结果:PCR鉴定和DNA测序,重组表达质粒gD2-Bacmind构建正确,空斑实验检测重组病毒滴度为2.0×109 pfu·mL-1,纯化的gD2重组蛋白在相对分子质量37 000处出现目标条带,纯度达90%以上.第6周gD2组小鼠免疫血清中gD2特异性IgG抗体滴度Log10平均值达到4.34,与PBS组比较差异有统计学意义(P<0.01).结论:利用昆虫-杆状病毒表达系统表达的gD2胞外区蛋白具有良好的免疫原性,可作为HSV-2疫苗的候选.
关键词： 生殖器疱疹 疱疹病毒2型 人 糖蛋白D 昆虫-杆状病毒表达系统 -
IL-2与HSV-1糖蛋白D共表达核酸疫苗的免疫效果研究
目的:研究白细胞介素-2(IL-2)与单纯疱疹病毒1型(HSV-1)糖蛋白D(gD)基因共表达的核酸疫苗对小鼠免疫效果的调节作用.方法:构建表达HSV-1 gD基因的核酸疫苗IRES-gD及共表达HSV-1 gD与IL-2基因的重组质粒IRES-gD-IL-2,给BALB/c小鼠股四头肌注射,检测各组特异性抗体、中和抗体水平以及血清IgG2a/IgG1比值;并测定迟发型超敏反应(DTH)的强度;通过病毒攻击实验观察各组小鼠的生存情况.结果:IRESgD-IL-2组产生的抗体及中和抗体滴度明显高于IRES-gD组.IRES-gD-IL-2免疫小鼠的IgG2a和IgG1含量及DTH反应均较IRES-gD组明显增高,但两组小鼠的生存率无显著性差异.结论:IL-2基因与HSV-1gD基因共表达可全面增强小鼠对核酸疫苗的免疫应答,尤其可增强细胞免疫效果.
-
疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白D多聚核苷酸疫苗的初步免疫评价
将疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)糖蛋白D(gD)多聚核苷酸疫苗肌注免疫豚鼠,初步评价其在体内所诱发的体液免疫和细胞免疫反应水平.将12只豚鼠分为3组,各组分别于舌肌注射pcDNA-gD多核苷酸疫苗、pcDNA3质粒及生理盐水,每周1次,共3次.ELISA检测豚鼠血清中gD抗体的水平;MTT法评价脾T淋巴细胞增殖反应.pcDNA-gD免疫组全部豚鼠均诱发抗HSV-2抗体(0.283±0.075);pcDNA3质粒组(0.062±0.015)和生理盐水组(0.057±0.016)的抗HSV-2抗体为阴性.pcDNA-gD免疫组豚鼠脾淋巴细胞增殖反应(2.08±0.1 8)程度明显高于对照组(P＜0,01).提示疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白D多聚核苷酸疫苗可在豚鼠体内诱发体液免疫和细胞免疫反应.
-
抗Ⅱ型单纯疱疹病毒表面抗原gD单克隆抗体的制备及鉴定
制备抗Ⅱ型单纯疱疹病毒(Simplex Herpes VirusⅡ,HSV-2)表面抗原gD的单克隆抗体(mAb)并对其性质进行鉴定.以基因工程重组制备纯化的HSV2-gD为抗原免疫BALB/c小鼠,采用常规融合制备杂交瘤细胞,通过HAT选择培养、有限稀释法获得单克隆细胞株,用间接ELISA法、Western blot方法筛选和鉴定阳性杂交瘤细胞株.获得了4株可稳定分泌抗HSV2-gD抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1A11C6、1A11F10、4C9D5以及4C9E9,抗体的类型均为IgG1,轻链均为K型,Western blot结果显示各单抗都可以特异性识别HSV2-gD.用杂交瘤细胞注射小鼠制备腹水,腹水内的抗体效价均大于1×10-5,腹水内的抗体经硫酸铵-辛酸分级沉淀和阴离子交换柱纯化,成功制备了纯度超过95％的高特异性抗体,抗体有较好的特异性.为进一步研究HSV2感染和临床上的预防、诊断及治疗提供了有力的工具.
-
热休克蛋白70-Ⅱ型单纯疱疹病毒糖蛋白D DNA疫苗的构建及表达
目的:针对Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-2)包膜糖蛋白D(gD),以热休克蛋白70(Hsp70)为载体,构建pVAXHsp70-HSV2gD DNA疫苗.方法:将Hsp70和HSV-2gD蛋白的基因分别克隆至真核表达载体pVAX,构建成重组质粒pVAX-Hsp70-gD并测序鉴定.重组质粒pVAX-Hsp70-gD转染COS-7细胞,用免疫组化、SDS-PAGE和Western blotting方法鉴定重组质粒的表达情况.结果:测序证实重组质粒序列正确,表达产物的SDS-PAGE分析发现,在相对分子量为92000处有外源蛋白表达,与预期蛋白带一致.免疫组化方法和Western blotting也证明,构建的重组质粒能在COS-7细胞内表达.pVAX-Hsp70-HSV2gD组核酸疫苗免疫的小鼠,其脾淋巴细胞培养上清中γ-干扰素的水平高于其他组(P＜0.05).结论:成功构建了pVAX-Hsp70-HSV2gD DNA疫苗,为其进一步的研究打下了基础.
-
HSV-2病毒gD基因的扩增和测序
目的: 确定单纯疱疹病毒-2型(HSV-2)糖蛋白D的基因序列.方法: 从3位生殖器疱疹患者中分离出3株HSV-2,提取标本中病毒DNA,通过PCR扩增gD基因并进行测序,用CLUSTALW排序软件和GENEDOC32软件进行分析.结果: 样品1:有4个碱基发生突变,碱基序列的一致性为99.66%,并引起了4个氨基酸发生突变,氨基酸序列的一致性为99.24%.样品6:有1个碱基发生突变,碱基序列的一致性为99.92%,并引起了1个氨基酸发生突变,氨基酸序列的一致性为99.75%.样品8:有1个碱基发生突变,碱基序列的一致性为99.92%,并引起了1个氨基酸发生突变,氨基酸序列的一致性为99.75%.结论: 三株野生株的gD基因序列与已公布的序列基本一致,说明HSV-2型的gD基因具有较强的保守性,可成为HSV-2型基因疫苗的侯选抗原.
-
单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白D酵母表达载体的构建
目的:构建含有单纯疱疹病毒Ⅰ型包膜糖蛋白D全基因片段的克隆载体及酵母表达载体,为进一步真核表达重组gD蛋白奠定基础.方法:应用PCR方法从HSV-Ⅰ基因组中扩增糖蛋白D的全长基因,产物回收后与pMD-18T载体连接,并转化,经氨苄筛选及测序,建立克隆载体pMD18T-gD;克隆载体与表达载体双酶切后,产物连接、转化大肠杆菌JM109,筛选、测序后确定构建了酵母表达载体pGAPZαA-gD.结果:重组质粒pMD18T-gD和pGAPZαA-gD经PCR和酶切均出现相应长度的片段,测序结果证实为gD基因,序列分析同源性为99.66%.结论:成功构建了含有单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白D全基因的克隆载体及酵母表达质粒.
-
一种新型单纯疱疹病毒Ⅱ型DNA疫苗的构建及其初步研究
目的:构建新型的含单纯疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白D基因(gD)的卡那霉素抗性真核表达质粒pgD,并探讨其作为DNA疫苗的可能性.方法:通过PCR扩增、酶切、连接及克隆筛选从质粒pET-28a(+)和质粒peDNA3获得新型真核表达质粒载体pcDNAkan.再通过PCR从重组真核表达质粒pcDNA3-gD上扩增出HSV-2精蛋白D全基因序列(gD),后克隆重组获得含gD的重组质粒pgD.pgD作为DNA疫苗免疫小鼠,观察其对小鼠的免疫效果及保护作用.结果:pgD免疫小鼠后能产生特异性抗体,与对照组相比较具有显著性差异(P<0.01),在HSV-2病毒致死性攻毒实验中,pgD组存活率达75%.结论:重组质粒pgD能诱导小鼠产生特异性免疫应答,可为HSV的DNA疫苗研制提供科学依据.
-
单纯疱疹病毒I型DNA疫苗的构建
目的构建表达单纯疱疹病毒1型糖蛋白D的DNA疫苗.方法采用聚合酶链式反应(PCR),从HSV-1基因组中扩增出gD基因,插入中间载体pGEM-T,然后克隆入真核表达载体pcDNA3.1, 构建重组质粒pLy-D.经部分测序和限制性内切酶分析证实.将pLy-D转染Cos-7细胞,并肌肉接种ICR小鼠.用免疫组化和ELISA方法分别检测gD蛋白表达及小鼠血清中的特异性抗体.结果转染的Cos-7细胞中有gD蛋白的表达;经三次肌肉免疫接种的小鼠血清中有特异性HSV-1抗体产生.结论本研究构建的重组质粒pLy-D能够在哺乳动物细胞中表达目的蛋白,免疫接种后可以诱导动物产生免疫反应.
-
重组疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白D快速纯化方法的研究
目的:建立重组疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白D的快速纯化方法.方法:将已构建PWR450-gD2融合蛋白应用单一的APTG-琼脂糖亲合层析技术进行纯化.结果:纯化后的gD2融合蛋白,回收率达40%,纯度为98%.结论:纯化的gD2蛋白将为临床检测HSV-Ⅱ及流行病学研究提供重要的物质基础.
-
单纯疱疹病毒2型全长糖蛋白D抗原的原核表达及抗原性分析
目的:构建单纯疱疹病毒2型(HSV-2)全长糖蛋白D(gD)基因原核表达质粒,研究其编码的蛋白质在大肠杆菌中的表达,并鉴定重组蛋白的gD抗原性.方法:提取病毒DNA,PCR扩增出gD基因,克隆于原核表达载体pGEX-4T-1,并转化大肠杆菌BL21.PCR、双酶切及测序证实插入的gD基因序列正确后,IPTG诱导表达融合蛋白GST-gD,并进行免疫学鉴定.结果:获得了gD DNA.测序鉴定表明,该序列与Gen Bank中的序列一致,gD基因已正确插入到pGEX-4T-1中.重组融合蛋白表达载体pGEX-4T-gD经IPTG诱导后能在大肠杆菌中高效表达,Westem Blotting证实,该蛋白具有天然gD抗原性.结论:成功构建了融合蛋白表达载体pGEX-4T-gD,在大肠杆菌中获得了有效表达.并证实融合蛋白具有gD免疫原性.为进一步研究gD蛋白的免疫学特性,制备gD亚单位疫苗和单克隆抗体奠定了基础.
-
单纯疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白D基因的原核表达及鉴定
[目的]构建单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)糖蛋白D原核表达载体并鉴定其表达产物.[方法]用PCR方法特异性扩增HSV-2糖蛋白D基因片断,经双酶切后将其克隆到融合蛋白原核表达载体pGEX-1λT中.将重组表达载体转化大肠杆菌后进行诱导表达,表达产物进行Western-blot鉴定.[结果]重组表达载体诱导表达产物用SDS-PAGE证明含有相对分子质量(Mr)约60 kD的糖蛋白D/GST融合蛋白.Western-blot分析证实纯化之后表达产物在相对分子量为60 kD处有明显的阳性杂交带.[结论]重组原核表达载体诱导表达出的HSV-2糖蛋白D具有较好的抗原性,为以后的HSV-2糖蛋白D基因工程亚单位疫苗研究打下了基础.
-
Ⅱ型单纯疱疹病毒糖蛋白D在杆状病毒表达系统中的表达、纯化及免疫效果评价
目的 利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统对Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-2)糖蛋白D(gD2)进行表达,纯化后评价其免疫效果,以探索HSV-2重组亚单位疫苗的研制.方法 提取HSV-2 DNA作为模板,用聚合酶链式反应(PCR)扩增gD2基因,克隆至pFastBac HTA载体中,利用载体中的His基因标记gD2,通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达His-gD2融合蛋白,表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot检验,用镍柱进行纯化,免疫小鼠评价其免疫原性.结果 HSV-2 gD2在昆虫细胞Sf9中得到特异性表达,纯化后的重组蛋白诱导小鼠体内产生高水平的IgG抗体及中和抗体.结论 gD2基因在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中获得表达,表达产物表现出良好的免疫原性及中和活性,为发展HSV-2亚单位疫苗奠定了基础.
-
单纯疱疹病毒1型糖蛋白D核酸疫苗的构建及初步免疫观察
目的构建用于防治单纯疱疹的核酸疫苗并观察其免疫效果.方法用PCR反应,从HSV-1 F株基因组DNA中扩增出gD蛋白的全部编码序列,将其插入pcDNA3.1(+)的PCMV下游,构建HSVgD核酸疫苗,并用酶切分析和测序鉴定;通过中和试验、ELISA方法和攻击试验检测用pLy-D三次肌肉接种小鼠的免疫效果.结果经鉴定证实了HSV gD核酸疫苗pLy-D的构建;实验小鼠产生了对HSV-1特异性的抗体(抗体滴度:ELISA法1:203,中和试验法1:37),并经受了HSV-1病毒的攻击(存活率:70%).结论成功构建出了HSV gD核酸疫苗pLy-D,用其接种小鼠可以诱导产生特异性免疫反应,并具有良好的保护作用.
关键词： 单纯疱疹病毒 糖蛋白D 聚合酶链式反应(PCR) 核酸疫苗
