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嵌合中国河北株包膜蛋白基因的HCV细胞培养模型的传代分析
建立稳定的嵌合中国河北株包膜蛋白基因的丙型肝炎病毒(HCV)细胞培养体系,进行传代特性分析.本研究经体外转录获得嵌合中国河北株包膜蛋白基因的丙型肝炎病毒(HCV)全长RNA,脂质体法转染Huh7.5-CD81细胞,连续传代培养,进行Real Time RT-PCR、间接免疫荧光、Western blot、再感染试验与感染滴度检测及序列分析.结果表明:嵌合重组HCV RNA转染Huh7.5-CD81细胞后可产生感染性的病毒颗粒(HCVcc);传代过程中,Western blot可检测细胞内HCV蛋白的表达;IFA检测阳性细胞数逐渐增多,41d升至高峰,达80％～90％;RealTime RT-PCR检测传代细胞上清中HCV RNA拷贝数在104～107拷贝/mL;再感染实验嵌合HCVcc高感染滴度为104 ffu/mL.序列分析显示在传代后期嵌合的HCV包膜基因发生了适应性突变,导致6处氨基酸改变.结论嵌合中国河北株1b亚型包膜蛋白基因的HCV细胞培养体系可以产生具有感染性的嵌合HCV病毒颗粒,传代后感染性增强并且嵌合的HCV包膜基因发生了适应性突变.
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异基因造血干细胞移植后的嵌合状态分析
目的研究异基因外周血造血干细胞移植(allo-PBSCT)后T淋巴细胞和粒细胞嵌合状态与疾病复发、移植物被排斥和移植物抗宿主病(GVHD)等的关系.方法21例HLA完全相合allo-PBSCT患者,流式细胞仪分选出外周血粒细胞、T淋巴细胞,分别进行短串联重复片段(STR)-PCR扩增.结果移植后7 d时17/21例患者T淋巴细胞的植入程度高于粒细胞,供者嵌合比例(DC)分别为60%(15%～76%)和0%(0%～40%).除去移植后28 d复发且T淋巴细胞一直为混合嵌合(MC)1例,其余20例T淋巴细胞达到完全嵌合(CDC)的中位时间是21(14～102)d,粒细胞为14 d.T淋巴细胞比粒细胞更早植入,但达到CDC的时间较粒细胞晚.7例在疾病复发或移植物被排斥时,T淋巴细胞比粒细胞更早出现DC的下降,其中4例患者仅表现为T淋巴细胞出现DC的下降,而全骨髓细胞和粒细胞仍为CDC或无明显下降,骨髓象检查未见异常.而在减量、停用免疫抑制剂或供者淋巴细胞输注后,治疗有效的4例患者T淋巴细胞逐渐由MC变为CDC,并有3例在转变过程中出现急性GVHD.结论allo-PBSCT后进行白细胞亚群,尤其是T淋巴细胞的嵌合状态检测可以比全血或全骨髓样本更早发现供者细胞的植入、疾病复发或移植物被排斥,及时采取相应的免疫干预措施,提高移植成功率.
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嵌合角膜移植有利于移植物的预后
在同种异体移植中,受者对移植角膜的上皮(epithelium, EPI)和内皮的排斥效应不相等.内皮是主要的靶向组织,而EPI具有抑制炎症反应的特性,可以抑制同种异体免疫反应.美国Schepens 眼科研究所的研究人员假设经体外整合的嵌合角膜移植后,第三方角膜EIP不会使受者对供体角膜内皮表达的异源抗体产生免疫反应,从而有利于移植角膜的存活.
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染色体核型异常患者全基因组芯片扫描结果分析
目的：分析全基因组芯片扫描结果,明确全基因组芯片技术在染色体异常诊断中的临床价值。方法对本院2012年3月~2014年5月收治的5例染色体核型异常患者反复进行核型分析及全基因组芯片扫描,并分析全基因组芯片扫描结果。结果染色体嵌合2例,分别为46,XY/45,X,del(Y)；46,XX/47,XX,del(Y)(p11)。染色体倒位1例：46,XX,inv(9)(p11q13)。平衡易位1例：46,XX,t(4；7)(q24p25)。染色体微缺失1例：46,XX,der(22)(p11q34)。2例染色体嵌合患者提示Y染色体缺失,1例为AZFc、d区的sY152、sY157、sY253、sY255位点缺失,1例为AZFb、c、d区的sY126、sY152、sY157、sY253、sY255位点缺失。1例染色体倒位显示为阴性。1例平衡易位提示多片段缺失。1例染色体微缺失提示为8号染色体插入合并22号染色体缺失。结论全基因组芯片分析技术分辨率高,可用于多种疾病的临床诊断,具有重要的临床价值。
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非清髓异基因造血干细胞移植动物实验研究进展
本文介绍了应用不同的非清髓预处理方案,进行异基因造血干细胞移植,供体造血细胞稳定植入、诱导受体对供体特异耐受的动物实验研究进展,这对临床实践有指导意义.
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用PCR-VNTR法检测CML异基因外周血干细胞移植后动态嵌合状态的作用
目的明确移植后造血细胞来源及微小残留病,为临床治疗提供依据.方法对18例异基因外周血干细胞移植者,在移植后不同时间检测人类两个高度可变的串联重复序列(Viariable numbertandem repeated sequences,VNTR),动态观察分子嵌合状态,并监测染色体核型及标志基因.结果不同引物供受者的检出率有明显差异.单用马利兰(Bu)预处理的混合嵌合(Mix chimerism,MC)的发生率在移植后+14天较Bu加环磷酰胺(CY)高预处理的.移植后6个月持续MC者复发率可达20%.1例完全嵌合(Complete chimerism,CC)患者移植后6个月重新出现受者带型,后复发.在指导临床治疗方面,VNTR优于染色体核型及标志基因.13例持续MC者减量或停用免疫抑制剂,11例(84%)转为CC.结论应用PCR-VNTR动态检测移植后嵌合状态,可以评估预处理方案、预测高危复发并指导移植后治疗.
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胎盘来源细胞与母血、脐血细胞的嵌合
背景：胎盘中含有丰富的细胞群，因其中 CD34+细胞含量高而受到越来越多学者的关注，有望成为临床造血干细胞移植治疗血液病及其他恶性疾病的新来源。
目的：探索胎盘来源细胞的数量、集落形成能力及其与母体的嵌合程度。
方法：采用健康足月剖腹产妇的胎盘，灌注法及组织块消化法收集胎盘中细胞；流式细胞仪检测胎盘及脐血中 CD34+细胞比例；培养细胞集落，定期观察集落形态并计数；序列特异性引物 PCR 扩增技术及序列特异性寡核苷酸探针方法检测胎盘、脐血和母亲外周血的HLA类型；短串联重复PCR方法检测胎盘细胞、脐血细胞和母亲外周血细胞的嵌合情况。
结果与结论：胎盘中 CD34+细胞数量明显优于脐血，且胎盘具有体外多种集落形成能力，集落形成良好，同时胎盘提取细胞中含有母体来源成分。提示胎盘中细胞数量及其基本生物学特性使其有潜力成为临床造血干细胞移植的新来源。 -
HCV中和抗原表位与HBV S抗原嵌合病毒样颗粒的制备及纯化
目的 制备丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)中和抗原表位与HBV S抗原嵌合病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),并进行纯化和鉴定.方法 采用脂质体法分别将4个HCV中和抗原表位与HBV S抗原嵌合重组表达载体pCI-HBSE1、pCI-HBSE2、pCI-HBSE3、pCI-HBSE4转染HEK293T细胞,48 h后收集培养上清,获得自我装配的嵌合HCV中和表位的HBV VLPs,分别命名为VLPs-SE1、VLPs-SE2、VLPs-SE3、VLPs-SE4,蔗糖密度梯度离心,透析浓缩后,电镜观察VLPs,电化学发光法进行HBsAg定量,ELISA法检测嵌合VLPs作为包被抗原与HCV感染患者血清的反应.结果 电镜观察可见4种嵌合VLPs,大小约为22 nm;浓度高的VLPs-SE2 HBsAg含量达5.51×103ng/ml,该浓度可满足后续试验的要求;用混合VLPs作为包被抗原检测的HCV感染患者血清中和抗体水平稍高于单一VLPs作为包被抗原检测的水平.结论 成功制备了HCV中和抗原表位与HBV S抗原嵌合VLPs,为进一步评价VLPs体内诱导的中和抗体及中和抗体的保护作用奠定了基础.
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部分股骨移植:一个新的带血管的骨髓移植模型
目的:大鼠后肢移植是带血管的骨髓移植的主要模型,同时含有骨髓和骨髓微环境,有利于免疫耐受的诱导.但其成分复杂,为研究其中骨髓的作用,构建一个成分相对单一的带血管的骨髓移植模型.方法:以MHC不相符的近交系Lewis和BN大鼠分别作为供体或受体,将含血管蒂的供体2/3股骨移植到受体腹股沟区,显微吻合供受体间的股动静脉.实验分为3组:同基因移植组Lewis→Lewis；排斥组Lewis→BN;免疫抑制组Lewis→BN,术后给予环孢素A.通过大体和病理学检查观察各组移植物存活情况,外周血流式监测排斥组和免疫抑制组的嵌合水平.结果:术后7d,排斥组排斥反应显著,骨髓细胞明显减少、坏死,外周血嵌合水平几乎为0,而同基因移植组股骨存活良好,骨髓HE染色大致正常,可见髓腔内有大量的嗜碱性骨髓细胞；术后60 d,同系移植组和免疫抑制组的大体观察及组织病理学大致相同,均证实移植物存活良好,同时流式可见免疫抑制组术后7、28、60 d外周血中存在供体特异性的嵌合.结论:带血管蒂的部分股骨移植物是一个简便可靠的带血管的骨髓移植模型,嵌合分析表明其具有诱导耐受的潜能,有利于阐明异体复合组织中骨髓对免疫耐受诱导的作用和机制.
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同种异基因造血干细胞移植后基于血细胞嵌合状态的个体化免疫治疗
目的:研究同种异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后血细胞嵌合率变化与复发的关系;观察根据血细胞嵌合率变化给予个体化免疫抑制剂治疗和供者淋巴细胞输注(DLI)的疗效.方法:106例供者细胞顺利植入的allo-HSCT患者,采用聚合酶链反应(PCR)扩增短串联重复序列的方法,动态检测移植后T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞的嵌合率.根据血细胞嵌合率的变化调整免疫抑制剂剂量和DLI的使用.结果:6例患者在移植后2个月,供者T细胞嵌合状态一直为混合嵌合(MC),将免疫抑制剂减量后均达到完全供者嵌合(FDC).12例患者在移植后1～5个月,发生供者T细胞嵌合率下降,予免疫抑制剂减量后转为FDC.24例患者血液学复发或髓外复发(进展),有6例在复发前共发生10例次血细胞嵌合率下降,经免疫抑制剂减量或停药后一度回升至FDC,但终血液学或髓外复发.12例患者在复发或疾病进展后停用免疫抑制剂,共给予DLI 23例次,其中8例在DLI前或后给予化疗,终5例再次达到完全缓解,其余患者终均因疾病复发死亡.Ⅱ度及Ⅱ度以上急性移植物抗宿主病(GVHD)发生率为28.3%.慢性GVHD发生率为55.7%.中位随访期为17(1.5～90.0)个月,无病生存65例,死亡41例.67例标危患者预期3年生存率为59.0%;39例高危患者预期3年生存率为44.7%.结论:T淋巴细胞、NK细胞和B淋巴细胞的嵌合状态可作为血液恶性肿瘤复发的预测指标;基于血细胞嵌合率的个体化免疫治疗可以推迟甚至避免临床复发,且不增加急性GVHD的发生.
关键词： 同种异基因造血干细胞移植 嵌合 免疫抑制剂 供者淋巴细胞输注 -
大鼠骨髓输注诱导小肠移植免疫耐受模型的建立
目的: 建立一种输注异基因特异性供鼠骨髓细胞后再行异位小肠移植的大鼠模型. 方法: 选取近交系Brown-Noway(BN)大鼠30只为供鼠;Lewis(LEW)大鼠15只为受鼠, 2∶ 1随机配对.于术前麻醉处死BN大鼠,在无菌条件下提取股骨、胫骨的骨髓细胞,经LEWIS大鼠尾静脉输入,同时于术前经尾静脉,术后2、4、6 d经受鼠腹腔注射抗CD25单克隆抗体、CTLA-4Ig及抗CD154单克隆抗体,第8天行BNLEW大鼠异位小肠移植.小肠移植术后第7天经内眦静脉采血0.5 mL,用流式细胞仪检测淋巴细胞嵌合率,并观察大鼠超急性排斥反应(GVHD)、生存期、体质量和一般状况. 结果: 小肠移植后15只大鼠均未观察到GVHD.小肠移植后存活>5 d为86.7%,>7 d为80.0%,>14 d为60.0%,长存活>50 d. 结论: 输注异基因特异性供鼠骨髓细胞后再行大鼠异位小肠移植模型的建立,是进一步研究小肠移植特异性免疫耐受机制的模型之一.
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环磷酰胺诱导嵌合形成和免疫耐受产生的实验研究
目的:通过环磷酰胺诱导大鼠嵌合及免疫耐受的产生,并初步探讨其安全性和可行性. 方法:将Lewis大鼠随机分为三组.A组于实验前一天腹腔注射150 mg/kg环磷酰胺,第1天经尾静脉输注2×108个供鼠骨髓细胞;B组于实验前一天腹腔注射等渗盐水2 mL,第1天经尾静脉输注2×108个供鼠骨髓细胞;C组于实验前一天腹腔注射150 mg/kg环磷酰胺,第1天经尾静脉注射等渗盐水2 mL.观察各组大鼠移植物抗宿主病(GVHD)的发生.于输注骨髓细胞后第14天及移植皮肤出现排斥反应时,取外周血检查供鼠来源T细胞占总T细胞的比例.于第15天取供鼠腹部皮肤,进行皮肤移植,观察各组移植物存活时间. 结果:A组可观察到明显的GVHD,第14天和移植皮肤被排斥时,供鼠来源T细胞占总T细胞的比率分别为25.49%和0.06%.A组移植皮肤存活时间为29.3 d,显著长于B组(8.7 d)和C组(8.4 d). 结论:环磷酰胺可诱导嵌合免疫耐受的产生,在嵌合状态下可检测到供鼠来源的T细胞.当移植皮肤被排斥时,供鼠来源T细胞占总T细胞的比例显著降低.
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骨髓输注联合共刺激阻断诱导免疫耐受的研究进展
诱导移植器官受者特异性免疫耐受是解决目前长期使用免疫抑制剂带来的一系列不良反应及其对移植器官慢性排斥反应终的手段.骨髓输注诱导嵌合体的形成和共刺激信号的阻断,是目前诱导免疫耐受为看好的途径.现就骨髓输注与共刺激信号阻断诱导免疫耐受形成的机制、策略和临床应用进行综述.
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嵌合DNA疫苗HSP70的研究进展
分子伴侣热休克蛋白70(HSP70)具有明显的免疫佐剂效应,进化保守,无种属靶向特异性,作为免疫优势抗原可诱导体液和细胞免疫,提高嵌合DNA疫苗的免疫效果.大量研究表明嵌合DNA疫苗HSP70是有希望的新疫苗之一.
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异基因造血干细胞移植后嵌合状态的检测及其意义
异基因造血干细胞移植后供受体细胞嵌合状态的分析是评价植入状态的有效指标,可预测移植后排斥、复发及移植物抗宿主病的发生,从而评估预后、指导临床治疗.评价嵌合状态的标记主要有:红细胞抗原系统、免疫球蛋白的同种异型、细胞同工酶谱、HLA抗原系统,细胞遗传学标记如性染色体核型分析或Ph染色体等异常染色体标记,以及分子遗传学标记如限制性片段长度多态性、可变串联重复序列、短串联重复序列、单核苷酸多态性等,移植后应根据具体情况选择敏感有效的方法连续动态地监测供受体细胞的嵌合状态,从而及早准确地实施I临床干预,提高移植成功率.
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STR峰高与峰下面积在干细胞移植后状态判断的应用探讨
目的 探讨短串联重复序列(STR)信息位点的峰高与峰下面积在异基因造血干细胞移植后嵌合状态判断中的作用,寻找适合于异基因造血干细胞移植状态判断的指标.方法 分别采集两名无关供者及M2患者及其HLA全相合供者两组血标本,以白细胞含量为依据制备不同比例混合血样,提取DNA,使用STR试剂盒,建立PCR扩增体系,在ABI3100仪上检测扩增片段,筛选得到理想的信息位点,获取其峰高及峰面积进行移植嵌合率的计算.结果 各筛选位点以峰高或面积得出的模拟嵌合率间差异均无统计学意义,且各位点模拟嵌合率与制备的浓度梯度之间的相关系数均在0.9965以上.结论 峰高或峰下面积均可作为嵌合状态的定量监控指标.
关键词： 短串联重复序列 异基因造血干细胞移植 嵌合 -
戊型肝炎病毒嵌合蛋白的免疫应答的初步研究
目的:对含有HEV主要抗原表位的嵌合蛋白进行表达与纯化,并对其免疫原性进行研究.方法:将含有一段HEV ORF2基因片段(394～660 aa)和HEVORF3全基因的表达质粒pHEV23在大肠杆菌中进行异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,其表达产物经Ni2+-NTA树脂亲和纯化,透析复性.纯化蛋白免疫小鼠,用ELISA检测小鼠血清IgG抗体,T细胞增殖反应检测细胞免疫应答.以Western-blot检测纯化蛋白对患者阳性血清的免疫反应性.结果:纯化蛋白的分子量为 55 KDa,纯度达 90% 以上;实验组特异性抗体水平明显高于对照组;T细胞增殖反应实验组与对照组比较有极显著性差异.纯化蛋白能与患者阳性血清呈特异反应. 结论:嵌合蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性,为进一步研究开发HEV诊断试剂盒及基因工程疫苗提供了基础.
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造血干细胞联合骨髓间充质干细胞移植实验效果观察
目的:对骨髓间充质干细胞(MSC)在造血干细胞移植后造血重建中的作用进行探讨.方法:分离培养水囊引产4～5个月龄胎儿来源的骨髓MSC和脐血CD34+造血干/祖细胞(HSC),作为供体细胞.23只重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠作为受体,随机分成4组,137Cs全身照射350 cGy后,在4 h内从尾静脉输入供体细胞.①阴性对照组:5只,不输入任何细胞.②阳性对照组:6只,单纯输入HSC 5×106ml-1.③实验Ⅰ组:6只,输入HSC5×106ml-1和MSC 5×106ml-1.④实验Ⅱ组:6只,输入HSC 5×106ml-1和MSC 5×108ml-1.输注后观察各组小鼠的存活情况;每周计数外周血单个核细胞(MNC)总数;移植后第7周,PCR检测外周血人体细胞DNA,并用流式细胞仪测定供体骨髓人源细胞嵌合比例.结果:阴性和阳性对照组小鼠均于10 d内死亡,骨髓病理切片提示小鼠死于骨髓衰竭.实验Ⅰ、Ⅱ组小鼠均保持良好的生存状态,皮肤黏膜无溃烂、出血,毛发无缺损.实验Ⅰ、Ⅱ组外周血象逐渐回升,第3周,实验Ⅱ组外周血MNC数量(2.63±0.32)×109 L-1,高于实验Ⅰ组的(1.33±0.21)×109L-1(P＜0.01),第5周即恢复正常水平.第7周,实验Ⅰ、Ⅱ组小鼠外周血均检测出供体细胞;实验Ⅱ组人源细胞嵌合比例为(7.41±0.79)%,高于实验Ⅰ组(5.11±0.07)%(P＜0.05).结论:SCID小鼠致死剂量照射后,联合输入HSC和MSC可明显促进造血干细胞移植后造血重建,且不增加移植物抗宿主病的发生率.
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嵌合穿支皮瓣的发展与现状
随着显微外科技术的不断发展和成熟，穿支皮瓣在临床上的运用越来越广泛，效果愈加显著，在软组织缺损修复领域的王者地位毋庸置疑［1-2］。当创伤、感染、肿瘤切除等因素造成伴有肌（腱）及骨等复合组织缺损时，以单一组织结构的穿支皮瓣进行修复难以为继，采用逐渐成熟的嵌合穿支皮瓣技术具有较大的优势。Hallock［3］和 Koshima［4］为代表的学者对此类皮瓣进行了许多研究并转化临床。为全面了解嵌合穿支皮瓣并提高其临床应用价值，现将其相关研究进展综述如下。
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嵌合抗原受体基因修饰T淋巴细胞在肿瘤免疫治疗中的研究进展
随着肿瘤免疫学理论和技术的发展,免疫治疗在肿瘤治疗中的作用目益受到重视.T淋巴细胞在肿瘤免疫应答中起主要作用,基于T细胞的过继性细胞免疫治疗(ACI)在部分恶性肿瘤中取得了一定的效果,但在大多数肿瘤中疗效尚不能令人满意[1].近年来,一种新的免疫治疗方法嵌合抗原受体(CAR)基因修饰T细胞显示出的靶向性、杀伤活性和持久性为ACI注入了新的活力.
