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口服耐受对自身免疫性葡萄膜视网膜炎影响的实验研究
目的 观察口服牛视网膜S抗原对人S抗原多肽-35诱发的实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎(EAU)的影响.设计实验性对照研究.研究对象20只雌性纯种Lewis大鼠.方法 用人S抗原多肽-35诱发EAU,提纯牛视网膜S抗原诱导口服耐受,分高剂量组(2 mg/次)和低剂量组(0.2 mg/次),同时设实验对照组(胎牛血清蛋白).主要指标EAU发病情况和脾组织白介素-4(IL-4)和γ-干扰素(IFN-γ)的表达水平.结果 口服高剂量组的Lewis大鼠的EAU发病情况较实验对照组有显著减轻(P＜0.05),而且口服高剂量组Lewis大鼠脾组织IL-4的表达水平则高于实验对照组(F=4.214,P=0.017).结论 口服高剂量牛视网膜S抗原诱导的免疫耐受町以成功抑制人S抗原多肽-35诱发的实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎.(眼科,2008,17:250-253)
关键词： 口服耐受 实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎 S抗原 -
抚州市免疫儿童感染的HBV“a”抗原决定簇变异分析
①目的 研究抚州地区乙型肝炎免疫的儿童乙型肝炎患者HBV表面抗原区“a”抗原决定簇变异特征.②方法 将抚州地区按照免疫规划程序按时按质接受乙肝疫苗接种的儿童设定为研究对象,收集多中心获得性乙肝免疫儿童血清标本8618份,采用ELISA法筛选HBV表面抗原(HBsAg)阳性样本,提取阳性标本中的HBV DNA,应用聚合酶链反应(PCR)体外酶促扩增HBV S基因片段,将扩增所得到的目的片段进行序列检测,并与参考序列对比,分析儿童感染的HBV血清亚型,确定变异株“a”抗原决定簇的变异位点.③结果从8618份血清样品中,检测出158份HBsAg阳性标本(阳性率1.83％).PCR成功扩增HBV S基因并测序135份,112份属于B基因型,23份属于C基因型.B基因型中105份为adw血清型,7份为ayw血清型;C基因型均为adr血清型.分析发现16份标本存在“a”抗原决定簇变异(变异率11.85％);16份标本的“a”抗原决定簇24个氨基酸位点中,有7个位点发生突变(突变率29.17％);“a”抗原决定簇两茎环间的变异率、基因型间的变异率无显著性差异(P＞0.05).④结论在江西抚州地区乙肝疫苗免疫儿童人群中检测出HBV“a”抗原决定簇变异株,但未见特异位点突变的免疫优势变异株.
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眼前房内抗原注射抑制EAU的发生
目的:探讨眼前房内注射牛视网膜可溶性抗原(S抗原)在诱导眼免疫耐受中的作用.方法:自新鲜牛眼球中提取S抗原,注入Wistar大鼠眼前房内.1周后,皮内注射牛S抗原与弗氏完全佐剂乳化混合物.观察大鼠实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎(EAU)发作时间、临床表现及组织病理学改变;并以ELISA方法检测脾细胞培养上清液中的细胞因子.结果:前房预处理组(group A)EAU的发生率明显低于阳性对照组(group B),所有具有阳性体征者均有组织病理学改变.前房预处理组动物脾细胞培养上清液中的IL-4浓度明显高于阳性对照组;而IFN-γ水平明显低于阳性对照组.结论:前房内注射牛S抗原可以诱导大鼠眼免疫耐受,在很大程度上抑制EAU的发生和发展.
关键词： S抗原 免疫耐受 实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎 -
乙型肝炎病毒前S1、前S2和S抗原重组毕赤酵母表达菌株的基因和表达稳定性
目的 研究同时表达SS1、SS2两种多肽(含前S1、前S2和S三种抗原成分)的重组毕赤酵母工程菌株(GS115-SS1S2)基凶和表达的稳定性.方法 取工程菌原代种子,连续传代至30代,提取15和30代工程菌基因组DNA,PCR分别扩增SS1和SS2基因片段,克隆到pBluescriptⅡSK(十)载体中,进行基因序列测定.对第5、10、15、20、25、30代菌种进行培养和诱导,制备抗原粗提液,并用ELISA法检测其中的前S1、前S2和S的抗原性,同时用RPHA法检测抗原效价.结果 第15和30代菌种基因组中SS1和SS2基因序列与原始菌种完全一致,第5、10、15、20、25、30代菌种表达产物的前S1、前S2和S抗原均为阳性;菌种传至20代,抗原滴度无变化,25代和30代菌种抗原滴度有一定程度下降.结论 重组毕赤酵母工程菌GS115-SS1S2在20代传代过程中,基因和表达稳定性良好.
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丙型肝炎病毒中和抗原表位与乙型肝炎病毒S抗原嵌合基因重组真核表达质粒的构建及其在293T细胞中的表达
目的 构建丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)中和抗原表位与乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)S抗原嵌合基因真核表达质粒,并在293T细胞中进行表达.方法 从含HBV全序列的质粒pHBV中扩增HBV S抗原基因,在HBV S疏水区127和128位氨基酸序列处引入Age Ⅰ酶切位点,将HCV E1和E2区保守的线性中和抗原表位及HVR1的模拟表位基因分别插入该位点,获得嵌合HCV中和抗原表位的重组HBV S基因,将该基因克隆至真核表达载体pCI-neo中,构建重组真核表达质粒pCI-HBSE1～4.将4种重组真核表达质粒转染293T细胞,间接免疫荧光和Western blot检测嵌合基因的表达.结果 4种重组真核表达质粒经双酶切证实构建正确；4种重组质粒转染的293T细胞胞浆内可见较强的绿色荧光,Western blot显示,在相对分子质量约27 000处可见蛋白条带.结论 成功构建了HCV中和抗原表位与HBV S抗原嵌合基因真核表达质粒,其在293T细胞中可有效表达,为进一步制备嵌合HCV中和抗原表位的HBV S抗原VLP,研究中和抗体对HCV假病毒颗粒(HCVpp)和JFH-1HCV体外培养系统(HCVcc)感染的抑制作用奠定了实验基础.
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HCV中和抗原表位与HBV S抗原嵌合病毒样颗粒的制备及纯化
目的 制备丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)中和抗原表位与HBV S抗原嵌合病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),并进行纯化和鉴定.方法 采用脂质体法分别将4个HCV中和抗原表位与HBV S抗原嵌合重组表达载体pCI-HBSE1、pCI-HBSE2、pCI-HBSE3、pCI-HBSE4转染HEK293T细胞,48 h后收集培养上清,获得自我装配的嵌合HCV中和表位的HBV VLPs,分别命名为VLPs-SE1、VLPs-SE2、VLPs-SE3、VLPs-SE4,蔗糖密度梯度离心,透析浓缩后,电镜观察VLPs,电化学发光法进行HBsAg定量,ELISA法检测嵌合VLPs作为包被抗原与HCV感染患者血清的反应.结果 电镜观察可见4种嵌合VLPs,大小约为22 nm;浓度高的VLPs-SE2 HBsAg含量达5.51×103ng/ml,该浓度可满足后续试验的要求;用混合VLPs作为包被抗原检测的HCV感染患者血清中和抗体水平稍高于单一VLPs作为包被抗原检测的水平.结论 成功制备了HCV中和抗原表位与HBV S抗原嵌合VLPs,为进一步评价VLPs体内诱导的中和抗体及中和抗体的保护作用奠定了基础.
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含前S1、前S2和S抗原的重组乙型肝炎疫苗在小鼠中的免疫原性
目的 探讨包含前S1、前S2和S抗原的新型重组乙型肝炎疫苗(简称SS1S2疫苗)在小鼠中诱导体液和细胞免疫应答的能力以及在无应答小鼠中的免疫原性.方法 以不同剂量(2.0、0.5、0.125、0.03μg)的SS1S2疫苗或商品化单S乙型肝炎疫苗(简称S疫苗)免疫BALB/c小鼠,于免后1、2、4周时采血,采用ELISA法检测两组疫苗单只小鼠血清的S、前S1和前S2抗体.以SS1S2疫苗或单S疫苗于0和3周时免疫BALB/c小鼠,每只5μg,于每次免疫后1周处死一半小鼠,制备脾脏淋巴细胞,采用ELISPOT法检测分泌IFNγ的细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic Tlymphocyte,CTL)频数.以单S疫苗于0、2、4周时免疫NIH小鼠,于末次免疫后4周采血,测定S抗体,筛选无应答小鼠.将无应答小鼠分为两组,分别用SS1S2疫苗或单S疫苗加强免疫1次,于免后1个月采血,测定S抗体.结果 免后1、2周,2.0、0.5、0.125 μg的SS1S2疫苗组S抗体阳转率均高于同剂量的单S疫苗组,且能诱导前S1、前S2抗体产生,而单S疫苗组无前S1、前S2抗体产生;免后4周,两组疫苗的抗体阳转率在总体上继续增加,2.0、0.5、0.125μg的SS1S2疫苗组S抗体几何平均滴度(GMT)均高于同剂量的单S疫苗组,且有一定滴度的前S1、前S2抗体,而单S疫苗组无前S1、前S2抗体产生.初免后1、4周,SS1S2疫苗组小鼠IFNγ分泌细胞频数均明显高于单S疫苗组(P＜0.05或＜0.01).以0.5μg SS1S2疫苗或单S疫苗对经3剂单S疫苗免疫无应答NIH小鼠进行1次加强免疫后,SS1S2疫苗组小鼠抗体阳转率和GMT均明显高于单S疫苗组(P均＜0.01).结论 与商品化单S乙肝疫苗相比,SS1S2疫苗在小鼠中诱导的抗体产生时间较早,抗体阳转率和抗体滴度较高,还能诱导前S1、前S2抗体产生;SS1S2疫苗比单S疫苗诱导了更高水平的特异性CTL应答;在无应答小鼠中能诱导更大比例和更高滴度的保护性抗体产生,表现出更好的免疫原性.
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牛S抗原的提取、鉴定及EAU模型的建立
目的建立实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)动物模型,研究自身免疫病的发病机制 . 方法依据AI-Mahdawi等的方法并加以改进,自牛视网膜组织提取 S抗原,并用其免疫Wistar大鼠. 结果提取的S抗原与文献报告结果大致相同,免疫的Wistar大鼠全部出现典型的EAU病变, 观察临床症状及病理检测. 结论以牛S抗原免疫Wistar大鼠的EA U模型建立成功.
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乙型肝炎e抗原、s抗原对Toll样受体及共刺激分子表达的调控和影响
目的:探讨乙型肝炎e抗原、s抗原( HBeAg、HBsAg)对健康人外周血单个核细胞(PBMC) Toll样受体(TLRs)和共刺激分子表达的影响.方法:分别用HBeAg、HBsAg、空质粒以及卵清蛋白(OVA)作为无关蛋白刺激健康人外周血单个核细胞(PBMC),采用流式细胞技术检测各刺激组CD14+细胞TLR2、TLR4、CD86、PDL1的表达水平.结果:健康人PBMC经HBeAg或HBsAg刺激后,CD14+细胞表面TLR2、TLR4的表达明显低于未刺激组(P＜0.05),CD14+细胞PD -L1的表达则明显增高(P ＜0.05)；HBeAg刺激后同时可见CD14+细胞表面共刺激分子CD86的表达水平明显降低(P＜0.02).结论 HBeAg和HBsAg通过上调单核细胞表面PD-L1的表达,下调CD14+单个核细胞表面TLR2、TLR4和共刺激分子CD86的表达,削弱机体固有免疫系统的应答能力,降低启动特异性免疫的活化信号,从而导致免疫清除逃避.因此,HBeAg和HBsAg可能是促进HBV感染慢性化的重要因素.
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视网膜下腔相关的免疫偏离
目的确立视网膜下腔是否具有支持针对视网膜可溶性抗原 (S抗原)刺激诱导偏离式免疫反应的能力.方法将视网膜 S抗原接种于Wistar大鼠的眼前房和视网膜下腔.抗原接种后7d,使用 S抗原和完全福氏佐剂免疫受主动物.然后,通过足部刺激评估迟发型超敏反应(DTH).结果前房和视网膜下腔注射S抗原的动物没有发生抗原特异性DTH.与此相反,而未预先进行前房和视网膜下腔抗原接种组动物和结膜下S抗原接种组动物则诱发了剧烈的 DTH.结论视网膜下腔针对可溶性抗原具有诱导免疫偏离的能力.
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SARS S603-620表位核酸疫苗诱导BLAB/c小鼠产生特异性体液免疫应答
目的 构建SARSS抗原的B细胞表位核酸疫苗并观察其免疫效果.方法 将已经鉴定的SARS S抗原的B细胞表位S603-620的编码DNA序列插入真核表达载体PCI中,构建核酸疫苗(PCI-S603-620).使用EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ酶切,电泳及DNA测序鉴定.使用脂质体将PCI-S603-620转入293A细胞,使用ELISA检测其在真核细胞中的表达.使用PCI-S60-620免疫小鼠,ELISA检测其诱导的抗体情况.结果 对PCI-S603-620进行酶切鉴定,电泳结果表明目的基因片段分子量为100 bp左右.PCI-S603-620的DNA测序结果表明其序列与设计序列吻合.PCI-S603-620能在转染的293A细胞中表达.PCI-S603-620免疫小鼠可以诱导特异性抗体产生,效价为1∶400.该抗体可以特异性识别SARS S抗原.结论 成功构建SARS S抗原的B细胞表位核酸疫苗(PCI-S603-620).
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TIA-1通过影响肝细胞转录因子的活性调节HBV的e抗原和s抗原表达
目的 证明TIA-1分子具有调节HBV基因表达的功能.方法 TIA-1真核表达质粒pcDNA3-TIA-1,用脂质体转染HepG 2.2.15细胞后,ELISA检测e和s抗原的表达;RT-PCR检测与HBV复制有关的转录因子HNF1、HNF2、HNF3、HNF4、RXRa、PPARa、C/EBP的表达.结果 与正常的HepG 2.2.15细胞相比,转染pcDNA3-TIA-1质粒的HepG2.2.15细胞,其e抗原的表达量明显的增高,而s抗原表达量明显的降低.与正常的HepG 2.2.15细胞相比,转染pcDNA3-TIA-1质粒的HepG 2.2.15细胞中的HNF1、HNF2、RXRet mRNA含量有明显的下降.结论 TIA-1蛋白能通过影响与HBV复制有关的转录因子活性,调节HBV e抗原和s抗原的表达.
关键词： TIA-1 S抗原 e抗原 转录因子 HepG2.2.15细胞 -
上海地区无偿献血者乙型肝炎病毒隐匿性感染情况和突变分析
目的 了解上海地区无偿献血人群乙型肝炎病毒隐匿性感染的情况、病毒基因型的分布及S区氨基酸的突变情况.方法 对上海市血液中心2011年10月～2012年7月使用血清学联合核酸检测所作的常规血液筛查结果进行分析,综合乙型肝炎血清学标志物二对半检测结果,以判断献血者HBV DNA+标本的感染状态,从中选择部分HBsAg-HBVDNA+的隐匿性HBV感染(0BI)标本作S区巢式PCR、克隆测序,基因分型和突变分析.结果 从250 376(人)份无偿献血者标本中筛查出197例HBsAg-HBV DNA+,包括OBI 172例(0.069％)；经S区巢式PCR的47例OBI标本中,有17例扩增出S区:14例为C亚型、突变率为35.71％(5/14),3例为B亚型,有1例发生突变,突变主要发生在S抗原的主要亲水区(MHR).结论 上海地区无偿献血者OBI携带率为0.069％,S抗原MHR区的突变可能是OBI发生的贡献因素之一.
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针对HBVS区的siRNA的抗病毒活性
目的: 体外观察siRNA对HepG2 2.2.15细胞中乙型肝炎病毒(HBV)S-mRNA及HBsAg,HBeAg产生的影响. 方法: 设计并合成针对HBV S区的三条siRNA,构建含上述siRNA的表达载体pSilencer ZY1,pSilencer ZY2和pSilencer ZY3,pSilencer HK2测序及酶切鉴定后用脂质体介导重组质粒转染HepG2 2.2.15细胞,用酶免分析法对HepG2 2.2.15细胞上清中HBsAg,HBeAg进行检测,用逆转录聚合酶链反应检测HBV S-mRNA.结果: 成功构建了针对HBV S区的siRNA的表达载体,三条siRNA均可程度不同地抑制HepG2 2.2.15细胞上清中HBsAg,HBeAg的分泌,72 h抑制率达高峰,对HBsAg的抑制率分别为81%,29%及78%,对HBeAg的抑制率分别为35%,3%及49%,并有抑制HBV S-mRNA的作用.结论: 针对HBV S区的siRNA能明显抑制HBV的复制.
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丙型肝炎病毒构象性表位与乙型肝炎病毒S基因嵌合表达质粒的构建及其表达
目的 构建丙型肝炎病毒(HCV)构象性表位AR3与乙型肝炎病毒S抗原(HBs)嵌合的真核表达质粒,并在293T细胞中表达鉴定.方法 采用重叠拼接PCR法,将HCV AR3表位的基因插入pSVB-24H质粒中,构建pSVB-24H-AR3重组质粒;再用PCR法扩增出全长的AR3-S嵌合基因,将其克隆到pCMV-HA载体中,构建pCMV HA-AR3-S真核表达质粒.脂质体和PEI转染法导入293T细胞,Westernblot和ELISA法分别检测重组蛋白的表达及分泌情况.结果 PCR法分别扩增出pSVB-24H部分载体、HCV AR3及HBs部分基因共3条基因片段;利用两步重叠拼接PCR,扩增得到1118 bp的三片段拼接产物,双酶切鉴定重组质粒pSVB-24H AR3位置正确,测序分析表明插入序列及开放读码框正确,但细胞表达产物难以被抗-HBs识别;将完整的1 128 bp的AR3 S基因插入带HA标签的表达载体中,酶切鉴定和测序分析表明重组质粒pCMV-HA AR3-S构建正确,Western blot结果显示重组AR3-S蛋白可与HA抗体特异性反应;ELISA结果也显示细胞内能检测到较高水平的AR3 S重组蛋白.结论 成功构建pSVB-24H-AR3和pCMV HA-AR3-S嵌合表达质粒并在细胞中表达,为后续开展基于HBs的病毒样HCV颗粒疫苗研究提供了实验依据.
