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流行性乙型脑炎减毒活疫苗SA14-14-2E基因的稳定性
分别对SA14-14-2(PHK8代)疫苗株及其原野毒株SA14和另2个疫苗传代株[SA14-14-2(PHK17代)和SA14-14-2(鼠脑1代)]的E区基因进行了序列测定.结果表明,乙脑病毒减毒活疫苗SA14-14-2在PHK细胞上连传至17代时,发现2个氨基酸突变(E-331、E-398),但不是回复突变.虽然在毒力容易返祖的乳鼠脑内传1代后发生E-107个氨基酸回复,但与野毒株毒力相比仍然相差很大,无毒力返祖现象.在疫苗的实际质控工作中,对上述与毒力相关的基因进行监测,可能有助于发现减毒活疫苗的毒力水平,为疫苗安全性提供更可靠的检测手段.
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TACC蛋白与肿瘤
TACC蛋白家族的成员是中心体主轴的组成蛋白,被认为与多种肿瘤的形成相关.TACC蛋白可能通过调节染色体的稳定性,以及细胞内相关基因的转录,从而影响了肿瘤的形成.但是现有的研究尚不能阐明TACC蛋白在肿瘤中的确切作用.本文综述了近年来关于TACC蛋白与肿瘤关系的研究,并且着重介绍了TACC蛋白调控肿瘤形成的分子机制.
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甲型肝炎病毒疫苗株H2株的连续传代及其基因稳定性
目的 分析甲型肝炎减毒活疫苗H2株(hepatitis A virus H2 live attenuated vaccine strain)毒种H2M20K7(K7)经连续传代后病毒基因的遗传稳定性.方法 将H2株毒种K7用细胞工厂在人二倍体细胞KMB17中进行连续传代后,收获不同代次的病毒,提取病毒RNA,用二代高通量深度测序方法,测定不同代次病毒(K7,K10,Kll,K13,K15,K18)的全基因序列,对比分析病毒的基因变异率,同时对病毒的感染性滴度进行检测和对比.结果 H2M20K7主代毒种经连续传代后,不同代次病毒的全基因序列总体变异率较低,非同义突变率小于0.58％,基因结构稳定;在5'NCR非编码区域的基因突变率＜0.1％;在VP1/2 A、2C毒力位点区域突变率小于0.01％;不同代次病毒的感染性滴度维持在7.76～ 8.50 lgCCID50/ml之间,P值为0.981差异无统计学意义.结论 H2M20K7主代毒种、工作毒种、疫苗批病毒及经过连续传代后的各代次病毒基因结构稳定;在5'NCR非编码区未发生明显突变,毒力相关位点VP1/2 A、2B、2C等关键位点的基因均为减毒特征,变异率极低,未引起病毒毒力特征改变.病毒感染性稳定且符合要求,具有较好的遗传稳定性.
关键词： 甲肝病毒H2株 基因稳定性 二代高通量全基因测序 核苷酸序列 -
细胞壁缺陷对淋病奈瑟菌cppB基因稳定性的影响
细胞壁缺陷变异是细菌变异的一种特殊类型,细胞壁缺陷不但导致细菌的形态发生改变,也常常导致细菌代谢活性、致病性、遗传等多种特性发生改变.研究证实细胞壁缺陷可导致细菌丧失其R因子等质粒甚至造成细菌染色体基因碱基序列或活性发生改变,但关于细胞壁缺陷导致细菌隐蔽性质粒丢失或其碱基序列改变尚未见报道.为探讨细胞壁缺陷对淋病奈瑟菌隐蔽性质粒的影响,本文对青霉素诱导形成的淋病奈瑟菌细胞壁缺陷型的cppB基因进行了检测与分析.
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流行性乙型脑炎病毒活疫苗株SA14-14-2基因稳定性研究
目的通过研究流行性乙型脑炎活疫苗减毒株基因稳定性,从分子水平证实流行性乙型脑炎活疫苗的遗传稳定性. 方法分析流行性乙型脑炎活疫苗主种子、工作种子及其相应的疫苗病毒E蛋白基因核苷酸和氨基酸序列,并与其强毒株和基因库中乙脑病毒减毒株(AF315119)比较. 结果乙脑活疫苗主种子、工作种子及其相应的疫苗病毒的E蛋白基因核苷酸序列完全相同.这些病毒E蛋白的氨基酸序列与基因库中乙脑病毒弱毒株(AF315119)比较显示第E447位点氨基酸有差异. 结论乙脑病毒活疫苗减毒株遗传学特性稳定.
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靶向白血病特异性转录调节因子融合蛋白siRNA的研究进展
白血病是血液系统的恶性疾病.在各种致癌因子的作用下,血细胞分化受阻且增生能力增强,导致血细胞无限增生且替代了原有的正常细胞,诱发了白血病.与大多数实体瘤不同,超过50%的白血病病例有明显的特异染色体改变,比如染色体异位和翻转,而且白血病和实体瘤相比具有更强的变异基因稳定性.以上两点表明,靶向特异肿瘤基因的分子治疗对白血病来讲比实体瘤更有前景.由于RNA干扰技术能使特异基因降解,高效抑制特异基因的表达,而不影响正常基因的功能,因此采用siRNA对血液肿瘤的研究已有不少报道.
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RMP基因对肝癌细胞稳定性及迁移能力的影响
目的 研究RMP基因对肝癌细胞稳定性及迁移能力的影响.方法 将SMMC-7721细胞等量分为对照组和实验组.合成RMP基因的小干扰RNA真核表达载体,转染到实验组肝癌SMMC-7721细胞内,用G418筛选出实验组干扰RMP基因的细胞株,RT-PCR检测两组细胞内RMP基因的表达,划痕实验法检测两组细胞的迁移能力.结果 成功构建稳定的RMP基因干扰细胞株,与未干扰细胞对照组比较,实验组细胞p21基因表达减弱,细胞迁移能力降低.结论 RMP基因有维持肝癌细胞基因组稳定的重要作用,对保持细胞的迁移能力也有作用.
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乙型肝炎病毒前S1、前S2和S抗原重组毕赤酵母表达菌株的基因和表达稳定性
目的 研究同时表达SS1、SS2两种多肽(含前S1、前S2和S三种抗原成分)的重组毕赤酵母工程菌株(GS115-SS1S2)基凶和表达的稳定性.方法 取工程菌原代种子,连续传代至30代,提取15和30代工程菌基因组DNA,PCR分别扩增SS1和SS2基因片段,克隆到pBluescriptⅡSK(十)载体中,进行基因序列测定.对第5、10、15、20、25、30代菌种进行培养和诱导,制备抗原粗提液,并用ELISA法检测其中的前S1、前S2和S的抗原性,同时用RPHA法检测抗原效价.结果 第15和30代菌种基因组中SS1和SS2基因序列与原始菌种完全一致,第5、10、15、20、25、30代菌种表达产物的前S1、前S2和S抗原均为阳性;菌种传至20代,抗原滴度无变化,25代和30代菌种抗原滴度有一定程度下降.结论 重组毕赤酵母工程菌GS115-SS1S2在20代传代过程中,基因和表达稳定性良好.
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乙型脑炎病毒SA14-14-2减毒疫苗株的生物学和基因稳定性
目的 研究乙型脑炎病毒(JEV)SA14-14-2减毒疫苗株传代过程中的生物学和基因稳定性,为疫苗的安全性和免疫原性提供依据.方法 将JEV SA14-14-2减毒疫苗株PHKC7代病毒在原代地鼠肾细胞(PHKC)上连续传代,检测各代次病毒的培养特性以及第8、12、17和22代病毒的安全性及免疫原性;对起止代次病毒(PHKC8和22代)进行全基因组序列测定,对中间代次病毒(PHKC12和17代)的结构蛋白基因进行测序,并与基因库乙脑病毒SA14-14-2株(D90195)比较.结果 各代次病毒产生的细胞病变基本一致,病毒滴度在17代前较稳定;在BHK21细胞上形成的蚀斑形态一致;小鼠脑内的致病力未发生变化,乳鼠传代返祖试验高代次病毒毒力有升高趋势.8、12、17和22代病毒免疫小鼠后,对P3强毒攻击均具有保护作用.E蛋白核苷酸和氨基酸序列,PHKC8代与D90195完全一致;而PHKC12、17和22代出现单个碱基(第2 142或2 143位)突变,导致E389氨基酸改变(D→N或D→A),但并非回复突变.4个代次病毒的PrM-C区结构蛋白基因均未发生变化.PHKC8、22代病毒的其他核苷酸突变发生在基因组非结构蛋白区和3'端非编码区;全序列PHKC8和22代与D90195比较,发现7～8个核苷酸不同,导致3～4个氨基酸的差异,核苷酸和氨基酸的同源性分别大于99.93%和99.88%,且以上突变不存在于明确的相关减毒位点上.结论 JEV SA14-14-2减毒疫苗株在PHKC上连续传15代,仍保持高度的生物学和基因稳定性,疫苗生产用病毒控制在10代以内较为安全.
关键词： 乙型脑炎 减毒活疫苗 SA14-14-2株 基因稳定性 生物学稳定性 -
麻疹病毒长-47纯化株(2BS细胞)毒种库的建立
目的 建立以人胚肺二倍体细胞(2BS)为基质的麻疹病毒长-47纯化株毒种库.方法 将麻疹病毒长-47纯化株毒种(CEC)主代主种子批适应于2BS细胞,传至第4代和第8代,分别作为主种子批及工作种子批,对毒种进行鉴别试验、无菌试验、支原体检查、外源因子检查和病毒滴度检测,并对主种子批毒种进行猴体神经毒力试验和猴体免疫原性检测.将毒种连续传代,观察各代次病毒的收获时间,并测定病毒滴度,分析毒种的传代稳定性;将主种子批和工作种子批分别置于-20和-70℃保存,不同时间取样,检测病毒滴度,分析毒种保存温度稳定性;选取4个代次毒种(D4、D8、D15、D19)提取病毒核酸,扩增H基因序列,分析H基因在传代过程中的遗传稳定性.结果 主种子批和工作种子批毒种鉴别试验、无菌试验、支原体及外源因子检查均符合《中国药典》三部(2010版)要求,病毒滴度分别为5.88和6.00 log CCID50/ml,主种子批毒种具有良好的安全性及免疫原性.麻疹病毒长-47纯化株毒种适应于2BS细胞后,收获病毒时间一般在6～7d,病毒滴度稳定在5.5～6.5 logCCID50/ml之间.主种子批和工作种子批病毒于-20和-70℃保存10个月,病毒滴度无明显变化.D4 ～ D19代病毒无核苷酸发生改变,与麻疹病毒Chang-47(GenBank登录号:EF033071)比对结果显示,D4～D19代病毒核苷酸序列21 nt由G→C,属于同义突变,同源性达99.9％.结论 建立了麻疹病毒长-47纯化株(2BS)毒种库,并按照《中国药典》三部(2010版)要求进行了全面检定,为制备以人胚肺二倍体细胞为基质的麻疹减毒活疫苗奠定了基础.
关键词： 麻疹病毒长-47纯化株 人二倍体细胞 毒种库 基因稳定性 -
流行性乙型脑炎减毒活疫苗生产毒种(SA14-14-2株)及其疫苗的表型和E基因稳定性研究
目的对乙脑减毒活疫苗SA14-14-2株生产毒种及其疫苗病毒滴度、脑内毒力和E区核苷酸序列进行回顾性测定.方法应用乳金黄地鼠肾传代细胞(BHK-21)结晶紫蚀斑法进行病毒滴度的测定,小鼠脑内法检测疫苗脑内毒力.应用RT-PCR方法扩增SA14-14-2生产毒种和疫苗E区的核苷酸,经凝胶层析纯化的PCR产物直接用于测序或克隆到pGEM-T载体中,经酶切和PCR鉴定后进行测序.结果疫苗在-20°C保存长达10多年,疫苗病毒滴度下降不超过0.5 lg;脑内毒力未见毒力回升.病毒蚀斑形态仍保持较SA14野毒株形态小的特性;以不同批次疫苗和生产毒种提取的病毒RNA作为模板进行RT-PCR扩增,扩增的基因片段与预期大小一致;E区基因序列与野毒株差异的8个氨基酸没有一个发生回复突变.结论 SA14-14-2生产毒种及其不同年度不同批次疫苗的生物表型和E区核苷酸的特性是十分稳定的.
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沪191麻疹病毒疫苗株连续传代的基因稳定性
目的 研究沪191麻疹病毒疫苗株(S191)在原代鸡胚成纤维细胞中连续传代的基因稳定性,为评估和控制麻疹疫苗的免疫原性及安全性提供依据.方法 取S191的22代冻干主种子批在SPF原代鸡胚成纤维细胞上连续传代获得的23、26(用于生产的疫苗代次)、29、31和33代病毒液,提取病毒RNA,RT-PCR扩增后,进行全序列测定,并对病毒关键的保护性抗原进行核苷酸和氨基酸序列分析.结果 与22代全基因比较,核苷酸序列同源性:26代为99.96％,33代为99.92％;氨基酸序列同源性:26代为99.98％,33代为99.89％.26代疫苗病毒仅M蛋白第123位氨基酸由苏氨酸→赖氨酸,33代病毒有5个氨基酸差异.结论 26代S191麻疹疫苗疫苗病毒的基因结构高度稳定,疫苗可保持主种子病毒的免疫原性和安全性.
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BRD-Ⅱ风疹病毒疫苗株的连续传代及其基因稳定性
目的 观察上海生物制品研究所有限责任公司BRD-Ⅱ风疹病毒株(S-BRD-Ⅱ株)在MRC-5细胞中连续传代的基因稳定性,并比较该毒株与其他上市风疹毒株E1基因的差异.方法 将S-BRD-Ⅱ株病毒在MRC-5细胞中连续传10代,检测每代病毒的培养特性和E1基因序列,第28、29、33和38代病毒的ORF序列及第28、38代病毒的5'-和3'-末端序列,同时测定B-BRD-Ⅱ株(北京天坛)及进口疫苗风疹病毒株(RA 27/3)E1基因,并对各基因的核苷酸及其相应的氨基酸序列进行分析.结果 S-BRD-Ⅱ株病毒在MRC-5细胞上连续传10代,其培养特性、细胞病变(CPE)程度及病毒滴度基本稳定,S-BRD-Ⅱ株病毒E1基因未发生变异,与GenBank中登录的BRD-Ⅱ株比较,有一个特异性的沉默突变,与RA 27/3疫苗株病毒比较,有122个核苷酸位点及其相应6个氨基酸发生突变.第28、29、33、38代S-BRD-Ⅱ株病毒的ORF Ⅰ和ORFⅡ基因区域与GenBank登录的BRD-Ⅱ株病毒比较,有5个位点发生变异,且P150非结构蛋白编码区域基因出现大片缺失.第28和38代S-BRD-Ⅱ株病毒的5'-末端与GenBank中登录的BRD-Ⅱ株序列的5'-末端一致,而3'-末端有一个氨基酸发生突变.结论 BRD-Ⅱ风疹病毒疫苗株在MRC-5细胞中具有良好的传代稳定性,所有上市风疹病毒株的E1基因氨基酸序列差异不大.
关键词： BRD-Ⅱ风疹病毒疫苗株 基因稳定性 核苷酸序列 -
胃癌中DNA聚合酶β的突变及与胃癌分化程度的关系
肿瘤的发生是多个基因突变积累的结果.这些突变包括参与DNA复制和修复以及维持基因稳定性和完整性的基因,其中DNA聚合酶β(polβ)和肿瘤的关系受到越来越多的关注.polβ是一种修复酶,其突变的存在与一些肿瘤的发生有关[1,2].胃癌病因起源复杂,推测在其发生发展过程中一定伴有DNA损伤修复,然而有关胃癌中有无polβ突变国内尚少见报道.本研究对胃癌及癌旁组织标本进行polβ突变检测.
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支气管上皮癌前病变FHIT基因稳定性及其蛋白表达
FHIT基因位于3p14.2,为肿瘤候选抑制基因.FHIT异常表达广泛存在于肺、食管、胃、乳腺及肾脏等恶性肿瘤组织.实验表明FHIT参与细胞凋亡,FHIT与p53的联合基因治疗,启动两条或更多的凋亡途径,可抑制肿瘤生长[1].近来FHIT基因在肺癌前病变发生中的作用引起了特别的关注,因此我们对支气管上皮癌前病变FHIT基因稳定性及其蛋白表达进行检测,为FHIT基因应用于肺癌前病变的早期诊断及预防治疗提供实验依据.
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致突变剂敏感性与头颈肿瘤患者放化疗后第二原发肿瘤发生风险的研究
目的 探讨基因稳定性与头颈肿瘤患者放化疗后发生第二原发肿瘤(secondary primary tumor,SPT)的关系.方法 SPT组和无SPT组入组病例分别为67、47例,正常对照组40例.以博莱霉素作为致突变剂,分析既往有头颈肿瘤放疗±化疗史、发生和未发生SPT者,分析外周血淋巴细胞平均染色单体断裂数.结果 从初诊头颈肿瘤的年龄开始,SPT组至发生SPT的时间、无SPT组至后随访时间分别为16.73 ±6.31 (95％CI,15.19 ～ 18.27)和18.51 ±8.51(95％CI,16.01 ～21.01)年(F=1.643,P=0.203).发生SPT的部位主要是头颈部,病理类型以鳞癌居多.SPT组、无SPT组和对照组外周血淋巴细胞平均染色单体断裂数分别为0.88 ±0.29(95％ CI,0.81 ～0.95)、0.56 ±0.19(95％CI,0.50 ～0.61)和0.52±0.18(95％CI,0.46 ～0.58)个,差异有统计学意义(F=6.519,P=0.002).以≥0.5个断裂数/细胞作为博莱霉素敏感性高低的分界点,3组对博莱霉素敏感的百分比分别为85.07％、65.96％、52.50％,差异有统计学意义(x2=13.611,P=0.000).将SPT组设置为病例组,余为对照组,外周血淋巴细胞平均染色单体断裂数的ROC曲线下面积为0.829,标准误是0.037(P=0.000),该值为0.69时特异性和敏感性均较高.结论 头颈肿瘤患者潜在的基因不稳定性与SPT密切相关;发生SPT的潜伏期较长,超过10年;外周血淋巴细胞平均染色单体断裂数判断该患者人群发生SPT的风险有价值,≥0.69可以作为高危SPT的佳阈值,但需要进一步验证.
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肠道病毒71型传代稳定性研究
目的 了解EV71病毒传代稳定性,为手足口病的疫苗研究及预防提供参考依据.方法 将TZ35号EV71病毒株在Vero细胞连续传20代,对第1代、第20代毒株致细胞病变、感染细胞免疫荧光染色、病毒感染力、VP1基因核苷酸序列及氨基酸序列进行比对分析.结果 TZ35号EV71病毒在Vero细胞中连续传20代,其致细胞病变特点、感染细胞免疫荧光染色特点没有明显改变;VP1基因核苷酸序列没有改变;第1代、第20代CCID50/ml分别为5.5、7.25.结论 EV71病毒在Vero细胞中连续传20代,其生物学特性没有明显改变,VP1区基因序列没有改变,提示同一病毒株的遗传是相对稳定的.
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SYBR Green实时定量PCR分析灌注培养工艺中抗体基因稳定性
目的 采用SYBR Green实时定量PCR分析灌注培养工艺过程中工程细胞株抗体基因的稳定性.方法取灌注培养0、7、14、21、28、35 d的CHO细胞,用SYBR Green实时定量PCR分析其抗体基因稳定性.使用标准曲线相对定量法分析CHO细胞中β-肌动蛋白和抗体基因拷贝数,以抗体基因拷贝数与β-肌动蛋白基因拷贝数的比值表示工程细胞中抗体基因水平.结果 工程细胞株工作种子、发酵罐中不同时间点样品抗体基因拷贝数保持稳定,抗体基因拷贝数相对β-肌动蛋白基因为0.93±0.10,抗体基因相对含量与培养时间之间不相关( P = 0.938).结论抗体工程细胞株在灌注培养过程中抗体基因保持稳定.
关键词： SYBR Green 实时定量PCR 灌注培养 基因稳定性 工程细胞株 -
轮状病毒 LLR 疫苗株非结构蛋白 NSP4基因稳定性研究
目的研究轮状病毒（ RV） LLR疫苗株NSP4基因的遗传特征及基因稳定性，为疫苗的质量控制提供依据。方法将LLR株轮状病毒毒种LLR38代在原代牛肾细胞上连续传至49代，提取第38、43、44、49代病毒RNA。通过RT-PCR扩增NSP4基因片段，将其克隆入质粒pGEM-T中，进行序列测定与分析。结果 LLR株NSP4基因全长751 bp，含编码175个氨基酸的单一的开放读码框架（ ORF）。各代次病毒的NSP4基因核苷酸与推导的氨基酸序列完全一致，与GenBank中LLR参考株（ AY219873）进行比较，核苷酸与推导的氨基酸同源性分别为99．1％和99．7％，各关键功能区均未发生改变。与27株A～F不同基因群RV代表株进行比较， LLR株与A基因群RV的NSP4同源性较高，核苷酸推导的氨基酸同源性为89．2％～95．5％；与B、C、D、E、F基因群RV核苷酸推导的氨基酸同源性分别为83．5％～87．5％、85．2％～87．5％、65．9％～67．8％、27．6％～30．8％、77．8％；系统发生树显示LLR株与A基因群RV在一个分支内。结论轮状病毒LLR疫苗株在原代牛肾细胞上连续传代NSP4基因遗传特性极其稳定，从分子水平证明LLR疫苗株毒种及其生产的疫苗是安全的。
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流行性乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2E基因稳定性研究
为研究乙脑病毒减毒株SA14-14-2 E蛋白基因稳定性,将乙脑病毒减毒株SA14-14-2在原代地鼠肾细胞(PHK)上传至18代,应用RT-PCR分别扩增PHK6代、PHK7代、PHK8代、PHK13代、PHK18代E蛋白基因并测序后,与Genebank中乙脑病毒减毒株SA14-14-2(D90195)进行比较分析.PHK6、PHK7、PHK8代病毒与D90195 E蛋白核苷酸和氨基酸序列完全相同.PHK13、PHK18代病毒与D90195E蛋白核苷酸序列同源性分别为99.8%、99.7%,与D90195E蛋白氨基酸序列同源性分别为99.6%、99.4%.各代次病毒E蛋白与减毒相关氨基酸未发生改变,同时所有突变的氨基酸均非SA14原有的,故不是恢复性突变.结果表明乙脑病毒减毒株SA14-14-2的遗传学特性稳定,从分子水平证明乙脑病毒减毒株SA14-14-2及其生产的疫苗具有安全性.
