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中国有了全球首个手足口病疫苗
近日,国家食品药品监督管理总局通过了中国医学科学院医学生物学研究所自主研发的预防用生物制品1类新药——肠道病毒71型(EV71)灭活疫苗(人二倍体细胞)的生产注册申请.这是全球首个获批生产的手足口疫苗.这意味着今后中国的儿童将可以通过打疫苗的方式,提前预防EV71手足口病.
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肠道病毒71型灭活疫苗热稳定性研究
目的 研究肠道病毒71型(EV71)灭活疫苗(人二倍体细胞)生产过程中的中间产品及成品的热稳定性.方法 将不同批次EV71灭活疫苗的病毒收获液、疫苗原液以及疫苗成品分别置于不同温度保存.第0、6、12、24个月时选取存放于-20℃、4℃的病毒收获液及-20℃的疫苗原液的样品,第0、1、3、6、12个月时选取存放于4℃的疫苗原液的样品,第0、6、12、24个月时选取存放于4℃的疫苗成品的样品,第0、7、14、28、42、60天时选取存放于25℃的疫苗成品的样品,第0、3、7、14、21天时选取存放于37℃的疫苗成品的样品,检测样品的病毒感染性滴度(lgCCID50/ml;CCID50,cell culture infective dose 50％,细胞培养半数感染量)、抗原含量、内毒素含量、pH值等;对1 800只BLAB/c小鼠进行疫苗成品的腹腔免疫注射,同时针对每个温度下不同保存时间设立对照组,每组10只小鼠(注射无病毒抗原的稀释液),共150只.接种4周时每只小鼠采集尾静脉血500μl,检测血清的中和抗体效价,计算疫苗成品的半数有效量(ED50).采用随机区组方差分析,对不同温度下,不同保存时间的各项指标进行比较.结果 EV71灭活疫苗的病毒收获液在-20℃条件下,保存0、6、12、24个月时病毒滴度分别为(6.67 ±0.13)、(6.56±0.09)、(6.52±0.04)、(6.39±0.16) lgCCID50/ml;4℃条件下,各时间点的病毒滴度分别为(6.67 ±0.13)、(6.41±0.13)、(6.19 ±0.18)、(5.97±0.09) lgCCID50/ml,均随保存时间的延长呈下降趋势(F值分别为9.81和44.16,P值均＜0.05).疫苗原液在4℃条件下,保存0、1、3个月时的抗原含量均为(3 626.67±1 382.56) EU/ml,保存6和12个月时分别为(2 080.00±876.36)、(951.17±346.35) EU/ml.疫苗成品在4℃条件下,保存0、6、12、24个月时的效力分别为(31.00±2.71)、(32.93±3.22)、(39.37±3.44)、(46.04±3.25) EU/ml;在25℃条件下,保存0、7、14、28、42、60 d的ED50分别为(31.00±2.71)、(32.23±2.66)、(34.70±1.77)、(40.04±2.10)、(47.78±1.93)、(56.97±0.50) EU/ml;在37℃条件下,保存0、3、7、14、21 d的效力分别为(31.00±0.00) 、(36.20±0.00)、(41.87±0.50)、(53.25±0.50)、(64.84 ±0.58)EU/ml,ED50均随时间延长呈上升趋势,与初始值差异均有统计学意义(F值分别为28.49、215.15和156.12,P值均＜0.05).结论 在-20℃保存24个月或4℃保存6个月以内的EV71灭活疫苗病毒收获液,在-20℃保存24个月或4℃保存3个月以内的疫苗原液以及在4℃条件下保存24个月或25℃保存28 d或37℃保存7d以内的疫苗成品,其各项质量指标均具有较好的稳定性.
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STR图谱用于生物制品生产用人源细胞鉴别的研究
目的 研究短串联重复序列(STR)图谱鉴别方法在生物制品生产用人源细胞质量控制中的应用.方法 采用PCR-毛细管电泳分析方法,分别建立检测9个和16个人STR位点的方法鉴别人源细胞,并对来自不同生物制品生产单位、不同传代水平的病毒性疫苗生产用人二倍体细胞株及基因治疗制品生产用的293细胞进行STR图谱的检测和比较.结果 建立人源细胞株的STR图谱分析方法.13个单位提供的病毒疫苗生产用21株人二倍体细胞中,除1株细胞并非MRC-5细胞外,其他细胞均可认定为本细胞,且未发现交叉污染现象.而8个单位提供的12株基因治疗用293细胞的STR图谱则存在明显差异,提示该类细胞可能存在来源、基因修饰改造背景不清及传代过程中遗传特性不稳定的因素.结论 STR图谱分析灵敏度高、特异性强,可用于生产用人源细胞株/系间的鉴别.
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1例注射甲肝疫苗致过敏性休克的抢救体会
甲肝疫苗为甲型肝炎病毒减毒株接种于人二倍体细胞,培养后,经抽提和纯化,溶于含氨基酸的盐平衡溶液,用于预防甲型病毒性肝炎.我市自1993年以来注射甲肝疫苗14.5万余次,未出现过敏反应.今将1例因注射甲肝疫苗而致过敏性休克报道如下.
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人二倍体细胞狂犬病疫苗研究进展
狂犬病是一种人兽共患的病毒性传染病,在全球分布广泛,给人类健康带来巨大威胁.狂犬病是一种疫苗可预防疾病,其中人二倍体细胞狂犬病疫苗(human diploid cell vaccine,HDCV)是目前国际公认的安全性与免疫原性好的狂犬病疫苗.随着科技的进步,疫苗的生产工艺在不断的发展创新,国产HDCV通过生物反应器微载体培养工艺培养人二倍体细胞,采用层析纯化工艺对疫苗进行纯化,提高了疫苗的质量指标,为人类抵抗狂犬病提供更安全、有效的防控手段.本文从HDCV的培养工艺、纯化工艺、临床安全性和免疫原性等方面,对HDCV进行分析评述.
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树突状细胞体内外对肝癌细胞的抑制作用
目的:研究树突状细胞对肝癌等肿瘤细胞的直接作用.方法:用rhGM-CSF和rhIL-4从健康人外周血诱导树突状细胞,用ELISA和MTT法分别检测DC培养上清液中IL-12和TNF水平,用MTT法检测DC对肝癌细胞SMMC-7 721、QGY-7703、HEPG-2、Alexander,胃癌细胞SGC-7901,慢性髓原性白血病细胞K562、Burkitt's淋巴瘤细胞Raji和正常人二倍体细胞的抑制作用,同时用流式细胞术检测DC表面FasL的表达,后用DC进行人肝癌裸鼠皮下抑制瘤的抑制试验.结果:诱导7 d的DC对4种肝癌细胞和胃癌细胞均有不同程度抑制作用,随着效靶比的增加,DC对肝癌细胞和胃癌细胞的抑制作用逐渐增加;DC预防人肝癌裸鼠皮下移植瘤,其抑制率为97%.结论:DC进入机体后也可以非特异性抑制方式发挥抑癌作用,本研究丰富和拓展了肝癌DC疫苗的内容,为今后肝癌DC疫苗的研究奠定了基础.
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接种甲肝疫苗引起过敏反应2例报告
甲肝疫苗系用甲肝病毒减毒株,经人二倍体细胞培育制成.预防甲型肝炎效果肯定,接种方法简单,是被广泛用于人群的一种有价疫苗,接种反应极少见.笔者于2003年遇到2例接种甲肝疫苗引起过敏反应者,现报告如下,以提醒同行注意.
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轮状病毒P[2]G3株在人二倍体细胞KMBl7上的适应性
目的 探讨轮状病毒P[2]G3株在人二倍体细胞KMB17上的适应性.方法 轮状病毒P[2]G3株在猴肾细胞MA104上经蚀斑筛选纯化后,得到的克隆以不同MOI接种至人二倍体细胞KMB17上.用微量滴定法与蚀斑法平行检测病毒滴度,用免疫荧光法检测病毒的增殖情况,后进行病毒基因组稳定性检测.结果 经MA104细胞培养的轮状病毒P[2]G3株在人二倍体细胞KMB17上可产生明显的细胞病变(CPE),但病变出现的时间随病毒传代次数的增加而延迟,抗原性也逐渐减弱.通过蚀斑筛选纯化得到的克隆病毒,可在KMB17细胞上稳定地增殖.以0.05 MOI病毒量接种可产生稳定的CPE,时间为72～96 h.连续传代至第10代,病毒滴度达105.5PFU/ml,病毒基因组稳定.结论 轮状病毒P[2]G3株在人二倍体细胞KMB17上表现出毒力及增殖能力的衰退;经蚀斑筛选纯化可获得毒力较强的病毒株,并在KMB17细胞中稳定复制、增殖.
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麻疹病毒长-47纯化株(2BS细胞)毒种库的建立
目的 建立以人胚肺二倍体细胞(2BS)为基质的麻疹病毒长-47纯化株毒种库.方法 将麻疹病毒长-47纯化株毒种(CEC)主代主种子批适应于2BS细胞,传至第4代和第8代,分别作为主种子批及工作种子批,对毒种进行鉴别试验、无菌试验、支原体检查、外源因子检查和病毒滴度检测,并对主种子批毒种进行猴体神经毒力试验和猴体免疫原性检测.将毒种连续传代,观察各代次病毒的收获时间,并测定病毒滴度,分析毒种的传代稳定性;将主种子批和工作种子批分别置于-20和-70℃保存,不同时间取样,检测病毒滴度,分析毒种保存温度稳定性;选取4个代次毒种(D4、D8、D15、D19)提取病毒核酸,扩增H基因序列,分析H基因在传代过程中的遗传稳定性.结果 主种子批和工作种子批毒种鉴别试验、无菌试验、支原体及外源因子检查均符合《中国药典》三部(2010版)要求,病毒滴度分别为5.88和6.00 log CCID50/ml,主种子批毒种具有良好的安全性及免疫原性.麻疹病毒长-47纯化株毒种适应于2BS细胞后,收获病毒时间一般在6～7d,病毒滴度稳定在5.5～6.5 logCCID50/ml之间.主种子批和工作种子批病毒于-20和-70℃保存10个月,病毒滴度无明显变化.D4 ～ D19代病毒无核苷酸发生改变,与麻疹病毒Chang-47(GenBank登录号:EF033071)比对结果显示,D4～D19代病毒核苷酸序列21 nt由G→C,属于同义突变,同源性达99.9％.结论 建立了麻疹病毒长-47纯化株(2BS)毒种库,并按照《中国药典》三部(2010版)要求进行了全面检定,为制备以人胚肺二倍体细胞为基质的麻疹减毒活疫苗奠定了基础.
关键词： 麻疹病毒长-47纯化株 人二倍体细胞 毒种库 基因稳定性 -
细胞工厂在制备口服脊髓灰质炎减毒活疫苗中的应用
目的 采用细胞工厂替代转瓶培养Sabin株脊髓灰质炎病毒,制备脊髓灰质炎减毒活疫苗.方法 用细胞工厂和15L转瓶分别培养人二倍体细胞(2BS),扩增至36代后,分别接种0.20 MOI的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎工作代毒种,待细胞病变达100％时收获病毒液,加入保护剂(4.5 mol/L氯化镁溶液),制备单价疫苗,分别将Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3个型别的单价疫苗按照病毒数10∶1∶6的比例混匀,制备成三价疫苗半成品,分装入1 ml西林瓶中(每瓶为10人份剂量),即为疫苗成品.采用微量滴定法测定疫苗原液及成品的病毒滴度,同时进行其他各项检定,并考察疫苗成品的稳定性.结果 采用相同的感染复数接种病毒,细胞工厂制备的3个型别疫苗原液的病毒滴度均高于转瓶制备的疫苗原液,Ⅰ型平均滴度高0.17 log10CCID50／ml,Ⅱ型平均滴度高0.33 log10 CCID50／ml,Ⅲ型平均滴度高0.27 log10CCID50／ml;细胞工厂制备的疫苗成品3个型别的病毒滴度均高于转瓶制备的疫苗,三价疫苗的平均滴度均高于6.24 log10CCID50／ml,符合国内外标准;疫苗原液及疫苗成品的其他各项检定均合格;细胞工厂制备的3批疫苗成品于37 C放置2d,疫苗的总病毒含量不低于6.24 log10CCID50／0.1 ml,且病毒滴度下降未超过0.5 log10 CCID50/0.1 ml,于2～8℃放置9个月,疫苗的总病毒含量仍不低于6.24 log10CCID50／0.1 ml,均符合WHO的标准要求.结论 利用细胞工厂替代转瓶培养2BS细胞制备脊髓灰质炎减毒活疫苗,可获得高于转瓶培养3个型别疫苗的滴度,且工艺稳定,质量可控,可用于规模化脊髓灰质炎减毒活疫苗的生产.
关键词： 脊髓灰质炎减毒活疫苗 细胞工厂 人二倍体细胞 -
不同材质细胞培养容器培养甲型肝炎病毒的比较
目的 比较中性玻璃转瓶和聚苯乙烯细胞工厂两种材质的培养容器培养人二倍体细胞和甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)的差异.方法 采用相同的培养条件,在中性玻璃转瓶和聚苯乙烯细胞工厂中分别培养人胚肺二倍体细胞KMB17,并接种HAV H2株,倒置光学显微镜下观察细胞的形态变化;细胞接种病毒后第0、7、14、18、22、26、30天时取样,ELISA法测定病毒的感染性滴度,分析病毒的增殖动力学.结果 两种材质的容器培养的KMB17细胞的生长状态和形态无明显差异;HAV H2株增殖动力学相似;单位体积病毒收获液中的病毒产量无显著差异;聚苯乙烯细胞工厂培养的HAV的单位培养容积产量是中性玻璃转瓶的7.28倍.结论 聚苯乙烯细胞工厂和中性玻璃转瓶培养的人二倍体细胞和HAV均能良好生长,细胞工厂可替代转瓶成为新的疫苗规模化生产的细胞培养技术.
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不同细胞基质制备的麻疹减毒活疫苗质量比较
目的比较人二倍体细胞2BS株与鸡胚细胞制备的麻疹减毒活疫苗质量.方法观察两种细胞基质制备的麻疹减毒活疫苗的病毒滴度、稳定性、抗体阳转率及GMT.结果两种细胞基质制备的麻疹减毒活疫苗的病毒滴度分别为4.75、4.64和4.83LgCCID50/ml,热稳定性良好,低温保存20年的滴度无明显下降;人体免疫接种后均未出现局部与全身反应,抗体阳转率均为100%,GMT分别为36.14、28.38和78.76.结论两种细胞基质制备的麻疹减毒活疫苗质量无明显差异.
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甲肝病毒YN5D株在人二倍体细胞系W2上的适应性
目的 研究甲肝病毒YN5D株在人二倍体细胞Walvax-2(W2)上的传代适应性,并确定其在W2细胞上培养的适条件.方法 将甲肝病毒YN5株P23代采用混合吸附的方式接种于T225细胞培养瓶,连续传至30代,检测各代次YN5D株病毒的抗原滴度及感染性滴度;将甲肝病毒YN5D株P29代以不同的MOI接种W2细胞,以佳MOI接种细胞,确定佳收毒时间;建立甲肝病毒YN5D株三级种子库,并进行检定.结果 甲肝病毒YN5株连续传至30代,抗原滴度及感染性滴度均保持在10 240 EU/mL和7.00 lgCCID50、mL以上;当接毒比例为0.5 MOI时,抗原滴度及感染性滴度均达到高;当培养至24～28 d时,抗原滴度及感染性滴度均达到高,分别为2 560 EU、mL和7.24 lgCCID50/mL.三级毒种库各项检定结果均符合《中国药典》三部(2015版)要求.结论 确定了甲肝病毒YN5D株在人二倍体细胞系W2上的传代适应性,并优化了细胞工厂的培养条件,为人二倍体甲肝疫苗临床申报样品的制备工艺奠定了基础.
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一次性培养瓶在水痘减毒活疫苗生产中的应用
目的 比较一次性培养瓶与方瓶培养人二倍体细胞2BS株的效果.方法 接种相同浓度的人二倍体细胞2BS株至一次性培养瓶和小方瓶中,(37±0.5)℃静置培养3d,于显微镜下观察细胞生长状态,并进行细胞计数.用0.025 ～0.05 MOI水痘-带状疱疹病毒Oka株感染2BS细胞,(35±0.5)℃静置培养3d,待细胞病变达70％以上时,收获病变细胞,制备冻干水痘减毒活疫苗,并参考水痘减毒活疫苗注册标准及《中国药典》(三部)2010版,进行各项指标检定.结果 在接种2BS细胞浓度相同的情况下,与方瓶相比,一次性培养瓶可增加一定的细胞培养面积,细胞总数相对较高;一次性培养瓶培养的2BS细胞贴壁速度较快,呈梭形,密度高,方向性好,轮廓清晰,分布均匀,胞质饱满,而方瓶培养的2BS细胞贴壁速度较慢,生长不均匀;使用一次性培养瓶及方瓶培养2BS细胞生产的水痘减毒活疫苗,各项检定指标结果均符合《中国药典》(三部)2010版相关要求,在病毒滴度无明显差异的情况下,使用一次性培养瓶可使水痘疫苗产量大幅度增加.结论 使用一次性培养瓶培养人二倍体细胞2BS株生产的水痘减毒活疫苗疫苗产量较方瓶有较大幅度的提高.
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不同批次肠道病毒71型(EV71)灭活疫苗的一致性分析
目的 分析不同批次的肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)灭活疫苗(人二倍体细胞)全程免疫后免疫原性及安全性的一致性.方法 检测3批EV71灭活疫苗成品的抗原含量、游离甲醛含量、铝含量、内毒素含量、抗生素残留量,并免疫动物检测异常毒力及效力.采用随机、双肓的方法,将3批疫苗于第0、28天分别免疫900名6 ～ 72月龄的受试人群.于接种前(第0天)、完成2剂疫苗接种后28天(第56天),采集静脉血,分离血清,采用微量细胞病变法检测EV71中和抗体(neutralizing antibody,Nab)效价;于每次接种后30 min内记录即时反应,每剂接种后0～7d内记录各种征集性局部和全身症状,0～28d内记录非征集性不良反应事件,并在整个观察期间报告严重不良反应事件.结果 3批EV71灭活疫苗成品的各项检定结果均在合格范围内.经2剂EV71灭活疫苗全程免疫后,20120101、20120102和20120203批疫苗受试者的抗体阳转率分别为98.00％、95.67％和98.67％,易感人群(Nab＜1∶8)免后抗体阳转率分别为96.45％、92.44％和97.60％,非易感人群(Nab≥1∶8)免后抗体水平的4倍增长率分别为67.94％、65.63％和71.43％;免后抗体GMT分别为283.79、231.48和285.78,组间差异均无统计学意义(P均＞0.05).3批疫苗诱导的与疫苗相关的不良反应及严重不良反应事件,组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 通过比较3批疫苗的各项生产质量控制指标及其诱导的抗体水平,证实该疫苗的生产工艺较稳定.
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国产冻干人用狂犬病疫苗(人二倍体细胞)的安全性及免疫原性观察
目的 观察人二倍体细胞(human diploid cell,HDC)培养制备的国产冻干人用狂犬病疫苗(HDCV)的安全性及其免疫原性.方法 选取江苏省淮安市涟水县年龄在10 ～ 60岁的常住高危狂犬病感染的健康人,随机分为试验组和对照组,每组600人,按照“Essen”暴露后接种程序,分别于第0、3、7、14和28天经上臂三角肌肌内各注射1剂疫苗,试验组接种国产冻干入用狂犬病疫苗(HDCV),对照组接种进口冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞).所有受试者在每次接种后留观30 min,观察即时反应,并在第6、24、48、72 h观察局部和全身反应情况.在首剂免疫前和免疫后7、14、42 d采集全血标本,分离血清,采用WHO推荐的快速免疫荧光灶抑制试验(rapid fluorescent focus inhibition test,RFFIT)检测血清中和抗体,计算抗体阳转率及几何平均滴度(GMT).结果 所有受试者接种疫苗后反应轻微,均未发生Ⅲ级及Ⅲ级以上不良反应,所有不良反应均在72 h内恢复.试验组和对照组局部反应总发生率分别为7.67％和6.83％,全身反应总发生率均为5.00％,两组间比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).试验组和对照组首剂免疫后7、14、42 d的抗体阳转率分别为28.77％、100％、100％和28.72％、98.96％、100％,两组间比较,差异均无统计学意义(P＞0.05);血清中和抗体GMT分别为0.274 8、19.744 3、37.575 0 IU/ml和0.247 4、17.327 4、37.723 1 IU/ml,两组间比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 国产冻干人用狂犬病疫苗(HDCV)接种反应轻微,且具有良好的免疫原性.
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人二倍体细胞2BS株和KMB17株在疫苗研发中的应用
人二倍体细胞是WHO认可的更安全的疫苗生产用细胞基质,已成为全世界疫苗生产首选的细胞基质.我国自主研制的二倍体细胞2BS株和KMB17株来源于人胚肺细胞,因其无致癌性、无外源因子污染,且细胞性状比较稳定,越来越多地在人用疫苗研发与生产中使用.由于2BS和KMB17细胞对多种病毒具有敏感性,因此也作为细胞基质被应用于许多病毒性疫苗的研究开发.目前,用这两种人二倍体细胞生产的疫苗,包括甲型肝炎疫苗、脊髓灰质炎疫苗和肠道病毒71型灭活疫苗等,已在我国广泛上市.
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新建人二倍体细胞株国内外研究概况
在病毒疫苗生产中,人二倍体细胞较原代细胞更具优势,可解决原代细胞易受外源污染、稳定性差、抗原性不一致的问题,并可用于建立细胞种子库系统,利于质量控制.目前常用作细胞基质的人二倍体细胞株包括MRC-5、2BS、KMB-17、WI-38以及SV-1等.此文综述了国内外法规对人二倍体细胞株的要求以及质量评价,以促进人二倍体细胞株的建立及广泛应用.
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肠道病毒71型灭活疫苗上市后安全性监测与评价
目的 评价不同细胞基质制备的肠道病毒71型(EV71)灭活疫苗上市后常规免疫安全性.方法 EV71灭活疫苗疑似预防接种异常反应(AEFI)数据来源于中国免疫规划信息管理系统,为2017年接种EV71灭活疫苗后江苏省报告的监测数据;受种儿童人口学信息和接种剂次数来源于江苏省预防接种信息管理系统.结果 2017年江苏省共接种EV71灭活疫苗316889剂,报告AEFI 208例,报告发生率为65.64/10万剂(95％CI:56.72/10万剂 ～74.56/10万剂),其中一般反应55.54/10万剂(95％CI:47.34/10万剂～63.74/10万剂),异常反应7.89/10万剂(95％CI:4.80/10万剂～10.98/10万剂);不同细胞基质的疫苗AEFI发生率(χ2=35.61,P<0.01)和一般反应发生率(χ2=34.09,P<0.01)差异有统计学意义,异常反应发生率差异无统计学意义(χ2=1.88,P=0.17),均未见严重异常反应,208例AEFI均未住院且均痊愈.EV71灭活疫苗(Vero细胞)首剂接种一般反应发生率高于第二剂(χ2=6.94,P<0.01),不同季度接种EV71灭活疫苗(人二倍体细胞)一般反应发生率差异有统计学意义(χ2=18.86,P<0.01).结论 不同细胞基质的EV71灭活疫苗在常规免疫接种中AEFI发生率均不高,有良好的安全性;一般反应以发热为主,异常反应以过敏性-荨麻疹、过敏性皮疹和过敏性斑丘疹等过敏性反应为主.
关键词： 肠道病毒71型灭活疫苗 Vero细胞 人二倍体细胞 疑似预防接种异常反应 安全性 -
细胞生长促进试验筛选新生牛血清
目的 建立适合人二倍体细胞培养血清的筛选方法.方法 通过测定细胞倍增时间和进行细胞生长促进试验对15批次的新生牛血清作了筛选,并将筛选出的11批次血清用于大规模细胞培养,观察细胞的生长维持情况.结果 发现细胞倍增时间与相对生长率无明显相关性(P>0.05).在大规模细胞培养中,相对生长率97%以上的血清更适合二倍体细胞生长.结论 细胞生长促进试验比细胞倍增时间测定更能客观地反映血清促人二倍体细胞的生长能力.细胞生长促进试验可能是较佳的,筛选适合人二倍体细胞培养的血清的方法
