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黄柏提取物在体外对Vero细胞单纯疱疹病毒1型的抑制作用
目的:观察黄柏提取物在体外对单纯疱疹病毒1型的抑制作用.方法:以HSV-1型病毒感染Vero细胞,检测黄柏提取物对单纯疱疹病毒1型(HSV-1)引起的细胞病变的抑制作用,并用阿昔洛韦作对照.结果:黄柏提取物抗病毒的作用优于西药阿昔洛韦组(P＜0.05).结论:黄柏提取物浓度范围0.31～10mg/ml,对10-2和10-5稀释度HSV-1(Sm44株)所致的Vero细胞病变有剂量依赖性抑制作用,IC50值分别为4.19和1.12mg/ml.
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流感病毒对两种细胞敏感性的比较
目的 比较流感病毒对Vero细胞和MDCK细胞敏感性的差异及影响敏感性的因素,寻找流感病毒灭活试验的佳细胞.方法 用测定两种细胞感染病毒后TCID50值和血凝效价值的方法,了解流感病毒对两种细胞敏感性的差异.结果 Vero细胞和MDCK细胞接种流感病毒72 h,测得血凝效价分别为1:64和1:128;MDCK细胞的病变较Vero细胞明显.终浓度为5μg/ml的胰酶可提高两种细胞增殖流感病毒的血凝效价,但对TCID50值的大小无明显的影响.随着维持液中血清浓度的升高,两种细胞增殖病毒的血凝效价逐渐降低,MDCK细胞染毒后的TCID50值也明显减小.结论 流感病毒对MDCK细胞的敏感性高于对Vero细胞的敏感性,胰酶和血清能影响病毒对细胞的敏感性.
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精制Vero细胞狂犬病疫苗的研制及免疫学效果观察
目的 以Vero细胞为基质，研制新一代精制Vero细胞狂犬病疫苗。 方法 以CTN-1V10为生产毒株，以＜150代Vero细胞为培养基质， 采用转瓶旋转培养，按不同时间收获病毒液，经过澄清、浓缩、纯化、灭活制成精制Vero 细胞狂犬病疫苗。从以此工艺制备的疫苗中选取一批做为免疫学效果观察的受试疫苗。按暴 露后免疫程序接种63人，其中受试疫苗接种33人，法国维尔博狂犬病疫苗接种30人，观察不 良反应和测定中和抗体。结果 新研制的精制Vero细胞狂犬病疫苗 各项指标完全符合WHO的有关质量要求。两种疫苗全程免疫后中和抗体阳转率均为100%，中 和抗体受试组为11.94 IU/ml;维尔博疫苗对照组为11.69 IU/ml。结论 精制Vero细胞狂犬病疫苗不但制造工艺合理，而且副反应轻微，免疫原性 良好。
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新布尼亚病毒在非洲绿猴肾细胞中的培养与分离鉴定
目的 应用非洲绿猴肾(Vero)细胞培养并分离鉴定新布尼亚病毒.方法 在2009-2011年河南省信阳地区发热伴血小板、白细胞减少综合征病例的血清标本中,筛选出新布尼亚病毒RT-PCR检测阳性且保存质量较好的164份标本,在Vero细胞系中培养,观察细胞致病变效应,进行实时荧光RT-PCR、间接免疫荧光检测和电镜观察.选取10份PCR阳性产物进行测序,测序结果与GenBank公布序列进行比对.结果 164份标本经Vero细胞培养,未观察到明显的特异性细胞病变；有67份实时荧光RT-PCR检测阳性,阳性率为40.85％.10份标本的核酸相似度在97.8％ ～ 100％之间,与新布尼亚病毒分离株(登录号HQ141600.1)相似度＞99％；67份实时荧光RT-PCR检测阳性标本中有58份间接免疫荧光检测可见特异性的荧光颗粒,对1份实时荧光RT-PCR和间接免疫荧光检测均为阳性的标本进行电镜观察,可见80～ 100 nm的球形病毒颗粒.结论 Vero细胞适用于新布尼亚病毒的培养、分离和鉴定.
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新一代流行性乙型脑炎疫苗
流行性乙型脑炎(乙脑)是疫苗可预防疾病,近年开发新的Vero细胞乙脑疫苗是一个热点.介绍了五种以Vero细胞为基质的乙脑疫苗的研制情况及特点.
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红树林淡紫拟青霉EPS提取物体外抗HSV-1机制研究
目的 探讨红树林淡紫拟青霉胞外多糖(extracellular polysaccharides,EPS)提取物体外抗单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)感染的机制. 方法 以Vero细胞为病毒感染靶细胞,以不同浓度EPS提取物作用于HSV-1感染过程的各个阶段,MTT法测定提取物对Vero细胞的毒性作用和对HSV-1的直接灭活作用及对病毒吸附和生物合成的影响;采用RT-PCR检测该提取物对病毒gD基因US6和DNA聚合酶基因UL30表达的影响. 结果 EPS提取物对Vero细胞无促进增殖作用,其对Vero细胞的半数有毒浓度(CC50)为1 300.17 μg/ml,浓度在800 μg/ml以下时细胞存活率达90％以上;在25～800 μg/ml浓度范围内该提取物可抑制HSV-1吸附和生物合成,并表现出一定量效关系;浓度为800μg/ml时抑制率高,分别为39.5％和59.7％,与病毒对照组相比差异有统计学意义(P＜0.01),但并不能达到完全抑制.未发现该提取物对HSV-1有直接灭活作用.RT-PCR显示该提取物可干扰病毒US6和UL30基因转录,灰度扫描分析US6 mRNA丰度与病毒对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05);UL30mRNA丰度与病毒对照组相比差异有统计学意义(P＜0.01). 结论 EPS提取物对Vero细胞毒性较小,使用安全.该提取物具有一定的抗病毒作用,可抑制HSV-1吸附和生物合成,还可抑制US6和UL30基因转录.
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肾综合征出血热Vero传代细胞疫苗的研究
目的研究肾综合征出血热(HFRS)Vero传代细胞疫苗.方法将HFRS双价沙鼠肾细胞灭活疫苗的生产疫苗株Z10(Ⅰ型)、Z37(Ⅱ型)适应到Vero细胞上进行连续传代,并用不同代次的Vero细胞适应株制备Vero传代细胞疫苗.结果Z10、Z37株感染Vero细胞后第1代即可达到较高病毒滴度,并且在Vero细胞中持续传代适应,病毒滴度分别维持在6.25～6.75和6.50～7.00 logTCID50/ml之间,较为稳定.用不同代次的Vero细胞适应株制备而成的HFRSVero细胞灭活疫苗抗原效价和疫苗的病毒滴度有较大提高,反向间接血凝效价从Z10 Cp1 Vero细胞疫苗的阴性上升到Z10 Cp10 Vero细胞疫苗的1:64,从Z37 Cp1 Vero细胞疫苗的1:2上升到Z37 Cp10 Vero细胞疫苗的1:64;疫苗病毒滴度(logTCID50/ml)从Z10 Cp1 Vero细胞疫苗的4.25上升到Z10 Cp10 Vero细胞疫苗的6 50,从Z37 Cp1 Vero细胞疫苗的6.25上升到Z37Cp10Vero细胞疫苗的7.50.疫苗在抗原量和病毒滴度上基本符合中国生物制品的要求.结论HFRS Vero传代细胞疫苗的生产,疫苗株在Vero细胞中的连续传代适应起关键性作用.
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反义硫代寡核苷酸体外抑制柯萨奇病毒B3增殖的研究
目的 在CVB3易感的Vero细胞系中观察与 C V％RNA 5'NCR的nt 581-601区域互补的2l聚硫代AODN抗病毒活性。方法 采用MTT法测定细胞活性，直接观察CPE，测定培养上清TCID50，并分别用ELISA和斑点杂交法检测CVB3抗原及其RNA。结果 1.AODN可推迟和减轻CPE，且随AODN浓度增加，对CPE的抑制作用增强，感染细胞存活率也随AODN浓度升高而升高；2.AODN可抑制CVB3抗原表达及RNA的合成，且呈剂量依赖关系；3.培养上清中病毒滴度随AODN浓度升高而降低。AODN抗病毒活性在转染后48 h效果较好；10 μnol／L浓度抑制效果较好。本研究结果 也显示10 μnol／L SODN对CVB3感染细胞CPE有较弱的抑制作用，但RODN未显示抗病毒活性；AODN未显现对HSV-l感染细胞CPE抑制活性，但对其他肠道病毒如CVB5，Polio-1和ECHO-6有较弱的抑制活性。结论 AODN可能通过抑制CVB3RNA复制来抑制病毒合成。
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不同毒力的问号钩端螺旋体对Vero及J774A.1细胞的黏附和内化
目的探讨问号钩端螺旋体对传代细胞黏附和内化的能力及其差异. 方法实验中采用非洲绿猴肾成纤维细胞(Vero)和小鼠单核巨噬样细胞(J774A.1)细胞株.采用透射电镜、扫描电镜和Fontana镀银染色法,观察问号钩端螺旋体强毒株黄疸出血群赖型56601、弱毒株波摩那群波摩那型56608黏附细胞及内化能力及其差异,采用腐生性的双曲钩端螺旋体三宝垄群patoc型PatocⅠ株作为对照. 结果问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型56601株和波摩那群波摩那型56608株均能以一端或两端黏附于Vero及J774A.1细胞.钩体56601株和56608株对J774A.1的黏附率分别为49%和46.9%,对Vero细胞黏附率分别为24.2%和22.9%.钩体56601株和56608株可侵入上述2株细胞,在胞质内形成典型的吞噬泡.钩体56601株还可侵入宿主细胞核内,56608株则否.双曲钩端螺旋体三宝垄群patoc型PatocⅠ株不能黏附和侵入细胞. 结论两株受试的不同毒力问号钩体株均能黏附细胞,并以内化方式侵入细胞.细胞株的差异可明显影响钩体黏附和内化能力.问号钩体毒力的强弱可能与黏附能力无关,而与其侵入胞核的能力密切相关.
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Vero细胞传代过程中致瘤性的检测
目的 为生物制品生产及研究用Vero细胞体系传代过程中的遗传安全性评价提供实验数据.方法 对Vero细胞进行传代与冻存,并对不同代次Vero细胞进行体外与体内致瘤性检测,同时对不同代次Vero细胞的蛋白质表达进行差异性分析.结果 Vero细胞传代至270代并建立了14个细胞冻存库;不同代次Vero细胞体外与体内致瘤性检测结果均为阴性;200代以上的Vero细胞蛋白质表达水平有所变化.结论 Vero细胞传代过程中虽然体外与体内致瘤性检测结果为阴性,但蛋白质组学分析有差异性蛋白表达,这为Vero细胞传代过程中的遗传安全性评价提供了实验参考.
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基于Avicel-结晶紫染色空斑的中东呼吸综合征冠状病毒感染滴定与中和抗体检测方法
目的 针对中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV),建立安全、操作简易的空斑试验检测方法.方法 将MERS-CoV(EMC/2012)感染Vero或Huh7.5细胞,通过研究MERS-CoV感染后镜下细胞病变与染色后蚀斑,比较染毒时间(2 d和3 d)以及细胞培养覆盖物[琼脂、微晶纤维素-羧甲基纤维素钠复合物(Avicel)]对空斑试验的影响,确定MERS-CoV空斑试验适用的细胞类型、染毒时间以及细胞培养覆盖物,并将该方法用于MERS-CoV中和抗体的检测.结果 MERS-CoV感染Vero细胞后能形成清晰的病毒空斑;染毒后3 d后能稳定清晰地形成MERS-CoV特异性空斑;微晶纤维素-羧甲基纤维素钠复合物覆盖细胞所产生的病毒空斑较琼脂覆盖物更为清晰,操作简易,更易于在BSL-3实验室进行操作;该方法可用于MERS-CoV中和抗体的检测.结论建立了基于Avicel-结晶紫染色技术的适用于BSL-3实验室操作的MERS-CoV空斑试验方法,为MERS-CoV的滴定、中和抗体检测等提供了实验资料.
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H7 N9甲型流感病毒 Vero 细胞高产疫苗候选株的构建
目的：构建1株基于Vero细胞高产的H7 N9亚型流感病毒疫苗候选株，为应对人感染H7 N9病毒提供细胞介质的疫苗候选株。方法利用流感病毒反向遗传学技术，将H7 N9亚型流行株的HA和NA基因与高产疫苗骨架株PR8-4 mut的6条编码病毒内部蛋白的基因，通过6∶2重组法拯救出4mut-H7N9病毒。通过病毒学方法检测病毒在Vero细胞上的生长性状和病毒蛋白产量。结果4mut-H7N9病毒在Vero细胞上生产速度更快，可收获更多的病毒蛋白。同时，4mut-H7N9病毒没有改变胰酶依赖性，并保持在小鼠中的低致病性，保证了该高产疫苗候选株的安全性。结论通过6∶2重组法，以反向遗传学技术构建的4mut-H7N9疫苗候选株能够极大地提高病毒在Vero细胞中的增殖速度，可作为以Vero细胞为生产介质的H7N9高产疫苗备选株。
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深圳5例肠道病毒71型手足口病病毒株全基因组测序分析
通过RD细胞(横纹肌肉瘤细胞)和Vero细胞进行病毒培养的方法,分离到5株手足口病患者的EV71型病毒株,病毒命名为SZ/08-1/08/CHN、SZ/08-4/08/CHN、SZ/08-28/08/CHN、SZ/08-121/08/CHN和SZ/08-605/08/CHN.
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α27基因特异性siRNA对2型单纯疱疹病毒复制的影响
目的：探讨在RNA干扰技术条件上，干扰α27基因的表达对单纯疱疹病毒（ HSV）-2复制的影响。方法体外合成针对α27基因的四对siRNA（ R1、R2、R3和R4组）和阳性、阴性对照siRNA，用Lipofectamine2000转染vero细胞后接种HSV-2，感染后分别于12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h测定上清液病毒滴度。结果α27基因特异性siR-NA转染组在病毒复制早期（12～24 h）即出现明显的病毒滴度降低，病毒复制晚期，其病毒滴度仅稍微降低；其中，R2和R4组在病毒复制早期到晚期病毒滴度均较其它组低。结论α27基因特异性siRNA能够抑制HSV-2的复制，降低子代病毒滴度。按照同样设计原则合成的不同序列siRNA，其抑制效果存在明显差异。
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疫苗生产传代细胞系Vero的同工酶分析研究
目的 通过对传代Vero细胞系的同工酶分析,确保Vero细胞作为病毒培养基质的安全性.方法 用聚丙烯酰胺凝胶不连续电泳法使同工酶得以分离.结果 所获Vero细胞系同工酶谱条带数量清晰、同工酶组成未发生改变.结论 该传代Vero细胞系可以作为疫苗生产的原始细胞库细胞.
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Penner 19空肠弯曲菌毒素的细胞毒性作用研究
目的探讨Penner 19空肠弯曲菌毒素(CJT)对细胞毒性的影响.方法 (1)应用CHO及Vero细胞检测CJT毒性效应,以及CJT抗血清和GM1中和/抑制作用;(2) ELISA检测CJT结合GM1、CHO细胞受体,评价CJT抗血清及GM1中和或抑制作用.结果 (1)CJT对CHO和Vero细胞均具毒性,效应低CJT量均为3.125 mg/L,细胞变形率分别为(57.3±5.6)%及(58.6±5.2)%,变形细胞中死亡率分别为(53.8±6.2)%及(37.2±6.9)%.对照组细胞变形率分别为(8.6±2.1)%及(7.3±2.4)%,显著低于CJT组(P＜0.01).(2)与GM1呈阳性反应的CJT低量为1.563 mg/L,吸光度差值(P-N)为0.24±0.01(P＞0.20).(3)CJT抗血清可中和CJT毒性效应,其1∶8及1∶1倍稀释时,细胞变形率分别＜50%和＜10%,与对照组比较差异有显著意义(P＜0.01).(4)GM1由0.01增至0.08 μg/100 μl时,CJT致细胞形变率逐渐下降,继续增加GM1剂量(0.08～0.64 μg/100 μl),细胞变形率却维持不变,且始终大于50%.(5)CJT结合CHO于作用后3 min明显.CJT抗血清及GM1均可导致CJT结合CHO细胞能力减低.CJT抗血清完全抑制;而GM1部分抑制.结论 CJT对细胞可产生形态及致死性变化,在其毒性损伤过程中,除GM1受体外,还应有其他受体参与毒性反应的启动过程.
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超滤截留狂犬疫苗残留DNA的工艺优化和机制探讨
目的：通过优化生产工艺来控制以VERO细胞为载体的狂犬疫苗生产中的残留DNA。方法采用双抗体夹心ELISA法检测评估抗原回收率，通过DNA探针杂交法检测残留DNA。采用检测抗原回收率和DNA残留率对狂犬疫苗生产中的核心环节－超滤的3个关键因素：超滤膜包的选择、超滤压力以及浓缩倍数进行评估，并评价鱼精蛋白预处理超滤液对于上述两指标的影响。结果与结论综合抗原回收率、DNA去除率以及生产层面的因素，获得了超滤工艺的优条件，即以截留相对分子质量为7．5×105的超滤膜包、20倍浓缩和15 psi的超滤压力作为超滤工艺的核心参数。通过鱼精蛋白的预处理，初步探明超滤截留是通过分子筛的模式截留DNA，而鱼精蛋白的加入可以结合碎片化的DNA，形成较大的分子片段，从而更利于超滤截留。
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SYBR-Green实时定量PCR用于Vero宿主细胞DNA残留量的检测
目的:建立基于SYBR-Green荧光染料实时定量PCR检测Vero宿主细胞DNA残留量的方法.方法:提取Vero细胞基因组DNA,设计细胞基因组高度重复顺序AGMr( HindⅢ)-1基因片段的特异性引物,通过PCR扩增AGMr( HindⅢ)-1序列中一段特异性cDNA片段,克隆至pGEM-T Vector,重组质粒经酶切及测序鉴定合格后命名为pGEM-T/AGMr( Hind Ⅲ)-1-S.结果:使用重组质粒和细胞基因组DNA分别作为检测标准品,均取得了良好的结果,其检测灵敏度分别达到了0.03 fg·μL-1和0.03 pg· μL-1.结论:SYBR-Green实时定量PCR可用于Vero宿主细胞DNA残留量的准确定量.
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轮状病毒LLR株在两种不同细胞中病毒滴度的比较
目的:通过轮状病毒LLR株在牛肾细胞和Vero细胞中培养效果的比较,为轮状疫苗的生产筛选佳的细胞基质和培养条件.方法:将轮状病毒LLR株按MOI 0.02分别接种牛肾细胞和Vero细胞,在相同培养条件下进行培养,每天观察两种细胞病变的情况,同时抽样检测病毒滴度,分析两种细胞对轮状病毒LLR株的敏感性.结果:牛肾细胞在感染轮状病毒LLR株后d3病毒滴度达到高,为6.8 lgCCID5o· mL-1；而Vero细胞在感染轮状病毒LLR株后d8病毒滴度达到高,为7.3 lgCCID50·mL-1.轮状病毒LLR株在牛肾细胞和Vero细胞上均能达到满意的病毒表达量.结论:轮状病毒LLR株在Vero细胞中培养能够达到理想的病毒表达量,利用Vero细胞培养轮状病毒LLR株,有利于提高疫苗的产量和质量.
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单纯疱疹病毒Ⅱ型在Vero细胞中培养与增殖特性的研究
目的 研究单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)在非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)中培养及增殖的合适条件.方法 把HSV-2接种于Vero细胞中培养和传代,于不同时间收获病毒液并测毒力,进行不同培养条件的摸索.结果 pH值、残留牛血清是HSV-2在Vero细胞培养的影响因素,佳收毒时间为36～12h.在Vero细胞上培养病毒3～5代,病毒毒力较高.结论 建立了单纯疱疹病毒Ⅱ型在Vero细胞上培养增殖的初步方法,为下一步建立HSV-2的潜伏与激发细胞模型打下基础.
