首页 > 文献资料
-
H3N2流感病毒体外细胞传代引起的变异
目的 了解用不同来源MDCK细胞分离H3N2流感病毒时,HA和NA片段氨基酸变异情况.方法 选取H3N2流感病毒核酸阳性的咽拭子标本13份,分别在三种不同来源的MDCK细胞中传5代.对标本中病毒及细胞传代的病毒进行HA和NA基因序列测定,分析病毒传代后HA和NA片段变异情况.结果 与咽拭子中的病毒序列相比,MDCK 5代病毒和MDCK-parent 5代病毒均发生了HA和/或NA的突变.9株MDCK 5代病毒HA发生了P221L/P/H突变;8株病毒发生了NA片段的148位或151位的突变.2株MDCK-parent 5代病毒HA221位为多态性.13株病毒MDCK-parent传代后均发生了NA多态性,大多发生在151位.在MDCK-SIAT传5代后的病毒HA均无突变,3株有NA突变.结论 在对流感病毒进行抗原性分析前对病毒进行细胞传代会发生病毒的适应性突变.H3N2流感病毒在MDCK、MDCK-parent中传代后,会引起HA和/或NA突变;MDCK-SIAT传代,病毒变异明显减少.
-
2004～2005年山西省流感样病例的病原学检测
目的了解2004～2005年山西省流感流行季节流感样病例的病原学特征.方法在太原市的三所哨点医院和有流感样病例的地区、门诊部采集鼻、咽拭子,用MDCK细胞进行分离鉴定.结果采集到的454份标本,分离到B型流感病毒13株(2.86%),均为B/上海/361/2002类似株.分离到流感病毒的病人以10岁以下儿童为主(9/13),男女无显著性差异.各医院阳性分离率无显著性差异.三个地区报告的中、小学校疫情,经病毒分离和血清抗体(HI)检测,其中两地均可确定为乙型流感病毒引起的局部小流行.三所医院各年龄组分离的19株非流感病毒(4.18%)细胞病变特征一样,不能确定何病毒.结论2004～2005年山西省流感流行季节主要以乙型流感病毒为主.未分离到其他型病毒以及分离率较低,分析原因与流感样病例和标本采集时间的把握有重要的关系,另一方面也可能与所用细胞的敏感性以及细胞的状态有关,加强实验室的质量控制,应用两种方法进行病毒分离对于提高病毒的分离率是非常必要的.
-
2007-2008年泰安市流行期流行性感冒病毒分离及分析
目的 对山东省泰安市2007-2008年流行期流行性感冒(流感)病毒进行分离鉴定及分析,了解泰安市流感流行情况.方法 采集流感样病例(ILI)的咽拭子标本用犬肾传代细胞(MDCK)进行病毒分离,采用血凝抑制方法(HAI)进行流感病毒型别鉴定.结果 2007年10月至2008年3月共检测2所哨点医院ILI咽拭子标本28l份,分离剑流感病毒94株,阳性分离率为33.45%,经分型鉴定A型H3N2亚型51株,H1N1亚型1株;B型的Yamagata系39株,Victoria系3株.结论 2007-2008流行季中,泰安市流感病毒流行的优势毒株为A型H3N2亚型和B型Ymagata系,同时有A型H1N1亚型和B型Victoria系毒株的存在.
-
甲型流感病毒在MDCK细胞上培养条件的优化
目的 优化甲型流感病毒在MDCK细胞上的培养条件,提高甲型流感病毒的分离率和监测效果.方法 将三种甲型流感病毒液(甲型H1N1、季节性H1N1、季节性H3 N2)分别接种于MDCK细胞,通过比较不同的病毒接种量(25、50、75、100、125和150 μl/cm2)、不同的TPCK-胰酶添加浓度(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0和3.5μg/ml)以及不同的MDCK细胞增毒代次(连续盲传四代),对三种甲型流感病毒易感性的影响,确定其佳分离效果.结果 三种甲型流感病毒:甲型H1N1、季节性H1N1、季节性H3N2的佳病毒接种量分别为:100、75和75 μl/cm2;胰酶佳使用浓度分别为2.5、2.0和2.0 μg/ml;适宜的细胞增毒传代次数为:一代、二代、二代;低代次的MDCK细胞对甲型H1N1流感病毒的易感性高于季节性H1N1和季节性H3N2;甲型H1N1流感在培养后病毒的HA滴度低于季节性H1N1与季节性H3N2.结论 甲型H1N1流感病毒在MDCK细胞上的分离效果低于季节性H1N1与季节性H3N2;季节性H1N1流感病毒和季节性H3N2流感病毒的分离条件基本相同.
-
胸腺肽α1体内抗流感病毒作用的实验研究
材料与方法实验材料:①实验药物:胸腺肽α1(Tα1),受试药物,1.5mg/支,试验时用生理盐水分别配成0.02mg/ml、0.04mg/ml、0.08mg/ml低、中、高三个浓度,分装三个青霉素小瓶中备用.病毒唑(利巴韦林注射液),阳性对照药物,含量为100mg/ml.试验时用生理盐水配成13mg/ml浓度的药液.病毒株为流感病毒鼠肺适应株A/FM/1/47(H1N1),本实验室保存.在MDCK细胞中的组织半数感染量(TCID50)为10-4.细胞为狗肾细胞(MDCK),本实验室保存.②实验动物:健康昆明小鼠,雌雄各半,3～4周龄,体重18～20g,雌雄分别分组,由实验动物中心提供.
-
流感病毒对两种细胞敏感性的比较
目的 比较流感病毒对Vero细胞和MDCK细胞敏感性的差异及影响敏感性的因素,寻找流感病毒灭活试验的佳细胞.方法 用测定两种细胞感染病毒后TCID50值和血凝效价值的方法,了解流感病毒对两种细胞敏感性的差异.结果 Vero细胞和MDCK细胞接种流感病毒72 h,测得血凝效价分别为1:64和1:128;MDCK细胞的病变较Vero细胞明显.终浓度为5μg/ml的胰酶可提高两种细胞增殖流感病毒的血凝效价,但对TCID50值的大小无明显的影响.随着维持液中血清浓度的升高,两种细胞增殖病毒的血凝效价逐渐降低,MDCK细胞染毒后的TCID50值也明显减小.结论 流感病毒对MDCK细胞的敏感性高于对Vero细胞的敏感性,胰酶和血清能影响病毒对细胞的敏感性.
-
基于MDCK细胞单层的药物早期肾毒性检测初探
目的:初步探索基于犬肾小管上皮细胞(Madin-Darby canine kidney,MDCK)细胞单层的药物早期肾毒性检测方法.方法:将MDCK细胞培养于微孔滤膜上,待其形成完整的细胞单层.通过MTT试验分别选择对MDCK细胞没有明显抑制及具有明显抑制的不同质量浓度作用于细胞单层,24 h后进行荧光素钠透过性试验以及细胞单层两侧分泌的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyl transpeptidase,γ-GT)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性检测,同时用扫描电镜观察细胞单层结构.结果:选择3.13,6.25,12.5 mg·L-13种质量浓度的马兜铃酸(aristolochic acid,AA)进行毒性检测,其对MDCK细胞生长的抑制率分别为-0.93％,0.93％和24.30％.AA 3.13 mg·L-1没有对细胞单层的完整性造成破坏,荧光素钠不能透过细胞单层,而AA 6.25,12.5 mg·L-1在与细胞作用30 min后,能明显增加荧光素钠的透过(P ＜0.05,P＜0.1),其中12.5 mg·L-1造成的荧光素钠透过率增加更多.各组细胞单层两侧ALP,γ-GT的分泌没有明显改变,但12.5 mg·L-1能使LDH的分泌显著增加(P＜0.05).扫描电镜观察显示,AA 6.25,12.5 mg·L-1组细胞单层结构被破坏,表面出现大量小球状物体,细胞单层破损而变得不完整,有不同程度的微孔滤膜露出.结论:基于MDCK细胞单层,在AA对细胞生长没有明显抑制的浓度(6.25 mg·L-1),可以检测到药物对细胞的毒性损伤,提示建立在微孔滤膜上的MDCK细胞单层体系可以用于药物肾毒性的早期检测.
-
麻黄汤体外抗甲型H1N1流感病毒作用及机制研究
为探讨麻黄汤体外抗甲型H1N1流感病毒的作用及可能机制,该研究以感染甲型H1N1流感病毒的狗肾(MDCK)细胞为载体,细胞病变(CPE)法测定甲型H1N1流感病毒鼠肺适应株(A/PR8/34)对MDCK细胞的半数细胞培养物感染剂量(TCID50);采用阻断流感病毒侵入宿主细胞和抗流感病毒生物合成2种不同方式给药,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定麻黄汤体外抗甲型H1N1流感病毒的有效率(ER)、半数抑制浓度(EC50)和治疗指数(TI);并且通过实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测技术,分别在给药后24,48 h,考察麻黄汤对感染甲型H1N1流感病毒的MDCK细胞中病毒载量以及TLR4,TLR7,MyD88,TRAF6 mRNA表达的影响.实验结果显示,甲型H1N1流感病毒对MDCK细胞的TCID500为1×10-4.32/mL;2种给药方式抗流感病毒的EC50分别为4.92,1.59 g·L-1,TI分别为12.53,38.78,并且当质量浓度为5.00 g·L-1时,麻黄汤抗流感病毒的ER分别为50.21％和98.41％,说明麻黄汤可以阻断流感病毒侵入宿主细胞,并可显著抑制流感病毒在细胞内的生物合成;同时,相比于病毒组,给药后24,48 h麻黄汤各剂量组的病毒载量表达均显著降低,高、中剂量组显著下调了细胞中TLR4,TLR7,MyD88,TRAF6 mRNA的表达水平,从而表明麻黄汤发挥抗流感病毒的作用机制,可能与其抑制细胞内流感病毒的复制以及TLR4和TLR7信号通路中的相关基因有关.
-
欧意清热解毒软胶囊体外抗甲型H1N1流感病毒作用
目的 观察欧意清热解毒软胶囊抗甲型H1N1流感病毒作用,寻求有效的抗甲型H1N1流感病毒作用的中药方剂,为临床治疗甲型H1N1流感病毒感染提供理论依据.方法 观察甲型H1N1流感病毒感染MDCK细胞后引起的细胞病变效应(CPE),并用MTT法检细胞活性,采用治疗指数(TI)作为药物体外抗病毒效果的评价指标.以磷酸奥司他韦胶囊(达菲)作为阳性对照药物,从药物对病毒入侵细胞的阻断作用、直接灭活作用及增殖抑制作用3种方式检测欧意清热解毒软胶囊抗甲型H1N1流感病毒的效果.结果 清热解毒软胶囊可以明显抑制甲型H1N1流感病毒引起的细胞病变效应(CPE),对甲型H1N1流感病毒入侵细胞的阻断作用、直接灭活作用及增殖抑制作用的TI分别为(15.5±0.71),(0.55±0.07),(6.4±1.27)；达菲3种作用方式的TI分别为(0.4±0.14),(1.88±0.29),(4.6±0.15).结论 与达菲组比较,清热解毒软胶囊体外具有明显的阻断甲型H1N1流感病毒入侵细胞作用(P＜0.01),其抗流感病毒主要机制可能是阻断病毒入侵细胞,对细胞具有保护作用.进一步的效果需要体内实验证实.
关键词： 甲型H1N1流感病毒 MDCK细胞 奥司他韦 清热解毒软胶囊 -
细胞培养技术分离流感病毒及分离条件的研究
目的 分析芜湖市细胞培养分离流感病毒效果及影响分离的条件,提高流感检测水平,为流感防控提供科学依据. 方法 培养MDCK细胞并接种475例经芜湖市疾病预防控制中心流感监测阳性标本,收集病变细胞,经细胞凝集实验、红细胞凝集抑制实验进行流感病毒毒株鉴定,同时在培养液中加入不同浓度胰酶,以研究胰酶对流感病毒的影响. 结果 从475例PCR检测阳性流感病例标本中分离出278株流感毒侏,分离率为58.53％.其中H3型流感为98株,分离率为66.22％;B型Yamagata为106株,分离率为47.32％;新甲型H1N1为74株,分离率为71.84％.不同型别毒株分离率差异有统计学意义(x2 =22.72,P＜0.01).在接种咽拭子时,标本于35 ℃条件下吸附1h所获得的病毒滴度高,TPCK-胰酶浓度为2 μg/ml时病毒滴度高. 结论 MDCK细胞可用于不同型别流感病毒的分离,但分离病毒的滴度受标本吸附时间和TPCK-胰酶浓度等分离条件的影响.
-
适用于生产H5N1流感疫苗的MDCK亚克隆细胞的筛选及检定
目的 筛选对H5N1流感病毒高度敏感、低致瘤性的MDCK细胞亚株,并对该细胞株进行全面的检定及分析.方法 通过极限稀释法获得细胞亚株,再对各细胞亚株进行血凝滴度、受体丰度和致瘤性检测,筛选出安全性好、敏感性高的细胞亚株,然后对所筛选细胞亚株进行全面的检定.结果 通过细胞克隆试验,共得到108株单细胞亚克隆株,经两轮血凝滴度初筛后得到3株细胞,再经致瘤性及受体丰度比较后选定一株亚克隆株G1作为备选细胞株.核型分析显示该亚细胞株染色体数目众数为78,未发现细菌、真菌、支原体及外源因子污染.裸鼠细胞致瘤性试验显示在观察期末接种部位病理解剖与阴性对照组无显著性差异,细胞未显示明显致瘤性.以细胞裂解物和细胞DNA接种裸鼠,均未致裸鼠产生结节,病理解剖显示与对照组无显著性差异,细胞未显示致癌性.结论筛选出的MDCK-G1亚细胞株符合安全性和敏感性的要求,具有用于大流行流感疫苗生产的潜在可能性.
-
用MDCK细胞为种子细胞体外构建组织工程化肾小管片层的实验研究
目的 以MDCK细胞为种子细胞、胶原凝胶复合Matrigel为支架材料,采用组织工程技术体外构建组织工程化肾小管片层,观察不同浓度Matrigel以及静态拉伸作用对MDCK细胞在三维支架中极性重建并形成小管样结构的影响.方法 将培养的MDCK细胞与添加不同浓度Matrigel的液态Ⅰ型胶原混合,在12孔板内铸模形成MDCK细胞-胶原片层.通过相差显微镜、HE染色,免疫荧光染色等方法对细胞的生长情况及形成的三维肾小管结构进行比较和鉴定.在此实验的基础上,对片层施加静态托伸力,观察静态拉伸作用对细胞生长、小管样结构形成的影响.结果 随培养时间的延长,各实验组片层内的MDCK细胞逐渐增殖、黏附、聚集.单纯以胶原为支架材料的片层内MDCK形成囊腔状结构;添加Matrigel的胶原片层内MDCK细胞可形成管腔样结构,且低浓度Matrigel的胶原片层内细胞存活率高.静态拉伸作用能够刺激细胞的生长、管腔样结构的形成.结论 本研究应用组织工程技术,以MEDK细胞为种子细胞、添加Matrigel的液态Ⅰ型胶原为支架材料,培养过程中施加静态拉伸力,体外成功构建出组织工程化肾小管胶原组织片层,肾脏小管上皮细胞可在该支架材料中完成极性重建的自组装过程.
-
苯并呋喃羧酸类特异性尿酸盐转运体抑制剂的设计、合成及活性研究
目的:设计合成新型的、具有一定特异性的苯并呋喃类人尿酸盐转运体(human urate anion trans-porter-1,hURAT1)抑制剂,并对其进行活性测试.方法:以苯并呋喃为骨架,引入羧基,设计合成3个新化合物.将所得目标化合物分别对稳定转染hURAT1基因或人有机阴离子转运体(human organic anion transporter-1,hOAT1)基因的MDCK细胞进行[14C]尿酸摄取抑制试验或6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein,6-CFL)试验,探究化合物抑制细胞尿酸或6-CFL摄取能力.结果:成功合成了目标化合物B-1,B-2,B-3,并经过1H-NMR,MS的结构确证.体外hURAT1和hOAT1抑制活性筛选的结果显示,单羧酸化合物B-1,B-2具有较强的抑制hURAT1[14C]尿酸摄取活性,且化合物B-1表现出良好的hURAT1选择性.结论:设计合成了新型的具有一定hURAT1特异性的降尿酸化合物,化合物B-1的抑制活性及选择性均优于阳性对照药丙磺舒.
-
线粒体是双乙酰丙酮氧钒在肾上皮细胞中诱导产生活性氧物种的主要来源
本研究利用具有降糖效应的双乙酰丙酮氧钒确定其在两种肾上皮细胞系LLC-PK1和MDCK中诱导产生活性氧物种的来源.利用四种常用的荧光试剂分别检测了VO(acac)2诱导产生的过氧化氢(H2O2)和超氧阴离子(·O2)的水平并确定了它们在细胞内的主要来源部位.实验结果表明,VO(acac)2在LLC-PK1和MDCK两种肾细胞系中均能显著诱导ROS的生成,并且ROS主要来源于线粒体.本研究结果提示,可通过局部降低线粒体部位ROS的水平来减少钒化合物的毒性损伤,同时不影响钒化合物的活性.
-
双黄连抑制流感病毒诱导MDCK细胞程序化死亡的研究
研究显示,流感病毒在体内可诱导人体的呼吸道上皮细胞凋亡,在体外使宫颈癌细胞(Hela)和狗肾传代细胞(MDCK)凋亡[1,2].近来报道抗流感病毒药物可抑制流感病毒诱导感染细胞凋亡[3].但双黄连是否可抑制流感病毒诱导MDCK细胞凋亡少有报道.我们自2005年7月至2008年6月采用Annexin V及碘化丙啶(PI)双染并应用流式细胞仪检测双黄连对流感病毒诱导MKCK细胞凋亡的影响,报告如下.
-
沉默Kif5b赋予MDCK细胞干性
目的 观察沉默Kif5b对上皮细胞MDCK的影响并探讨Kif5b表达水平与细胞分化程度的相关性.方法 设计构建靶向Kif5b基因的短发卡RNA(shRNA)质粒载体,并转染犬肾上皮细胞株MDCK,检测其对Kif5b表达的抑制作用;采用Western blot法检测E-钙黏蛋白(E-cadherin),N-钙黏蛋白(N-cadherin),波形蛋白(vimentin)在各组细胞中的表达差异;通过细胞诱导液培养检测细胞分化为脂肪细胞和成骨细胞的能力.结果 从形态上看,对照组MDCK细胞间紧密相连,呈鹅卵石状分布,而Kif5b沉默的细胞呈成纤维细胞状;与对照组相比,转染Kif5b-shRNA显著抑制Kif5b的表达,同时E-cadherin的表达下降,N-cadherin和vimentin的表达上升,细胞抵抗胰蛋白酶消化的能力降低;沉默Kif5b的MDCK细胞能被分化为脂肪细胞和成骨细胞;此外,Kif5b在MDCK中的表达量显著高于小鼠间充质干细胞(mesenchymal stem cell).结论 在MDCK细胞中沉默Kif5b诱导MDCK细胞经历上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition)过程,去分化为间充质干细胞样细胞,去分化的细胞能够被转分化为特化的脂肪细胞和成骨细胞.Kif5b的表达量与细胞的分化程度呈正相关.
关键词： Kinesin-1 MDCK细胞 上皮细胞-间充质转化 间充质干细胞 -
金莲花汤不同提取物对细胞增殖的影响及体外抗病毒活性研究
目的 探讨不同提取方法的金莲花汤提取物(金莲花汤不同提取物)对小鼠巨噬细胞Raw264.7增殖以及对小鼠H1N1流感病毒活性的影响 方法 通过MTT法观察药物处理后对小鼠巨噬细胞Raw264.7生长增殖情况的影响;利用小鼠H1N1流感病毒感染MDCK细胞,进行病毒扩增并测定病毒效价;利用小鼠H1N1流感病毒感染小鼠巨噬细胞Raw264.7,采用MTT法结合CPE 方法 确定金莲花汤不同提取物的抗病毒效果.结果 MTT结果发现,金莲花汤不同提取物(20％、40％、60％、80％、95％、二次80％、二次95％及粗提取物)均对小鼠巨噬细胞Raw264.7增殖具有明显的抑制作用,IC50分别为0.063、0.064、0.145、0.065、0.064、0.064、0.105、0.2mg/ml;MTT结果结合CPE分析显示,60％金莲花汤提取物IC25及IC50的药物剂量有轻微的抗病毒效果;80％金莲花汤提取物IC0及二次95％金莲花汤提取物IC25的药物剂量抗病毒效果较好,差异有统计学意义.结论 不同提取方法的金莲花汤提取物对小鼠巨噬细胞Raw264.7增殖有一定的抑制作用;在体外抗病毒实验中,一定提取纯度的金莲花汤提取物对小鼠H1N1流感病毒有抑制作用.
关键词： 小鼠巨噬细胞Raw264.7 MDCK细胞 金莲花汤提取物 细胞增殖 抗病毒活性 -
泰安市2007-2008年度流感检测分析
目的 分析泰安市2007-2008年度流行性感冒的病原学检测结果,了解泰安市流感病毒亚型分布.方法 采集流感样病例(ILI)的咽拭子样品,用狗肾细胞(MDCK)进行病毒分离,采用血凝抑制试验(HI)和RT-PCR进行流感病毒型别鉴定.结果 检测国家级流感监测医院ILI咽拭子样品281份,分离出流感病毒94株,阳性分离率为33.45%,经分型鉴定、H3N2亚型51株,H1N1亚型1株,B型Ymagata系39株,Victoria系3株.结论 2007-2008年度泰安市流感流行的优势毒株为H3N2亚型和B型Yamagata系,同时有H1N1亚型和B型Victoria系毒株的存在.
-
龙岩市2010年度流感病原监测结果分析
目的 了解龙岩市2010年流感流行态势,为流感防治提供科学依据.方法 对流感监测哨点医院及各县(市、区)疾控机构送检的1 223人份流感样病例咽拭样本以MDCK细胞进行流感病毒分离培养.结果 检出流感病毒137株,阳性率11.2％.其中,甲型H1N1流感病毒3株,阳性率为0.2％；季节性流感病毒A3亚型流感病毒45株(3.7％),B型流感病毒89例(57.7％),未检出A1亚型流感病毒.龙岩市流感流行主要发生在1～3月及10～11月两个阶段.其中,1～8月以B型流感病毒流行为主,并存在B型yanagata系与B型victoria系流感病毒混合流行,流行强度相近.9月以后,突然转变为A3型流感病毒流行为主,流行强度也持续较高.流感病毒的感染无性别差异,但年龄特点显示以25～59岁为高发人群(43.8％),≥60岁人群感染率低.结论 龙岩市流感防控应加强对季节性A1亚型流感病毒可能造成的流行或暴发及≥60岁人群的预防工作.
-
流感病毒细胞培养时胰酶添加量的优化分析
目的 在流感病毒的培养体系中添加不同浓度的TPCK-胰酶,希望可以找到病毒培养效果好的胰酶浓度,提高病毒分离效果.方法 将四种流感病毒分别接种于MDCK细胞,加入不同TPCK-胰酶终浓度的病毒生长液,当CPE＞75％时进行收获,HA试验测病毒滴度.结果 甲型H1N1,季节性H3N2,乙型Victoria、乙型Yamagata出现血凝滴度的峰值对应的TPCK-胰酶的添加量分别为2.0、2.0～2.5、3.0,3.0μg/ml.结论 在实际工作中可以根据不同型别的流感病毒区分对待,分离乙型流感病毒时,适当增加胰酶含量,会取得比较好的分离效果.
