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红树林淡紫拟青霉胞外多糖体外抗HSV-1的实验研究
目的 探讨红树林淡紫拟青霉胞外多糖体外抗单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)感染的活性,为开发新型抗病毒药物提供实验基础.方法 以Vero细胞为病毒感染靶细胞,以不同浓度淡紫拟青霉胞外多糖作用于HSV-1感染的各个阶段,以细胞病变程度测定病毒半数感染量,MTT法检测淡紫拟青霉胞外多糖对Vero细胞的毒性作用、对HSV-1的直接灭活作用、对病毒吸附和生物合成的影响.结果 淡紫拟青霉胞外多糖对Vero细胞的半数有毒浓度(CC50)为1724.2μg/ml,该多糖浓度<900μg/ml时,细胞存活率仍>90%,且对细胞无增殖作用;在25~1000μg/ml浓度范围内,该多糖可在一定程度上抑制病毒吸附,并表现出一定的量效关系,半数抑制浓度(IC50)为650.7μg/ml;该多糖还具有抑制HSV-1生物合成的作用,其IC50为547.7μg/ml,在25~1000μg/ml浓度范围内,抑制率与药物浓度呈量效关系,未发现该多糖对HSV-1有直接灭活作用.结论 淡紫拟青霉胞外多糖对Vero细胞毒性较小,是一种非常安全的多糖;该多糖具有一定的抗病毒作用,在一定浓度范围内可抑制HSV-1吸附和生物合成,且表现出一定的量效关系.
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汉坦病毒H8205株IL-2/G1融合基因在Vero细胞中的稳定表达
目的探讨外源性 IL- 2/G1融合基因在非洲绿猴肾细胞( Vero)获得稳定表达的可行性,为汉坦病毒基因工程疫苗的研制提供一定的实验基础.方法将汉坦病毒 H8205株 G1的 cDNA重组人源 IL- 2基因后克隆到真核表达载体 pcDNA3.1/His,形成重组真核表达质粒 pcDNA3.1/His- IL- 2- G1,在脂质体介导下,将其导入 Vero细胞,通过 G418筛选获得阳性克隆,并继续培养 6周,然后通过间接免疫荧光、 ELSIA、 SDS- PAGE电泳等方法检测 IL- 2- G1基因在 Vero细胞中的稳定表达情况.结果成功构建重组质粒 pcDNA3.1/His - IL- 2- G1,其片段插入方向正确.经间接免疫荧光和 SDS- PAGE电泳证实,转染了真核表达质粒 pcDNA3.1/His- IL- 2- G1后在 Vero细胞培养上清和胞浆中有融合蛋白的表达,其相对分子量为 78 000 u,与预期的相符合.经人 IL- 2 ELISA检测试剂盒检测证实在培养上清和细胞裂解物所表达的融合蛋白有 IL- 2特性. 结论在脂质体介导下,外源性 IL- 2/G1融合基因能够成功导入 Vero细胞并获得稳定表达.
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艰难梭菌A毒素诱导SMMC7721细胞和Vero细胞凋亡的比较研究
背景与目的:艰难梭菌是假膜性大肠炎及抗生素诱发性腹泻的主要致病菌之一,它产生的毒素具有不同的生物学活性.本实验拟研究艰难梭菌 A毒素诱导人肝癌细胞株( SMMC7721)和非洲绿猴肾细胞( Vero细胞)凋亡的作用. 方法:由脑心浸液对艰难梭菌 VPI 10463菌株培养产毒 , 经甲状腺球蛋白亲合层析和 Q Sephrose层析提纯得到精制 A毒素.对 SMMC7721细胞的研究以 Vero细胞为对照.抑制细胞增殖的检测采用 MTT法;用荧光显微镜、电子显微镜、流式细胞仪观察细胞形态和细胞周期的改变;采用琼脂糖凝胶电泳法观测 DNA碎片.结果:不同浓度 A毒素 (0.293～ 4.690 mg@ L- 1)明显抑制了 SMMC7721及 Vero细胞的增殖,并且呈时间和浓度依赖性;两种细胞与 A毒素共同培养 48 h,荧光显微镜和透射电镜都观察到典型的凋亡形态变化; SMMC7721细胞与 A毒素共同培养 48 h后,琼脂糖凝胶电泳显示梯形条带.结论: A毒素明显诱导了两种细胞的凋亡 ; A毒素对 SMMC7721细胞具有更强的诱导凋亡作用.
关键词： 艰难梭菌 A毒素 细胞凋亡 SMMC7721细胞 Vero细胞 -
肠道病毒71型对Vero细胞线粒体的损伤作用及机制
目的：探讨肠道病毒71型（EV71）对Vero细胞的损伤作用及机制，为分析EV71的致病机制提供新思路。方法将临床分离的一株EV71接种于Vero细胞，观察细胞的形态改变，用免疫荧光方法检测EV71抗原在Vero细胞中的表达，用透射电镜观察Vero细胞超微结构的改变，用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件测试分析病毒颗粒直径和面积密度以及空泡化线粒体的比例和面积密度。结果 EV71感染后Vero细胞形态发生改变，由梭形变为圆形或死亡，免疫荧光检测显示EV71抗原定位于胞质，超微结构观察可见胞质中有大量呈团块状分布、晶格状排列的高电子密度病毒颗粒，颗粒平均直径为16.3 nm，平均面积密度为38.3%；线粒体肿胀、变性并空泡化、崩解，空泡化线粒体数量约占90.9%，平均面积密度为89.2%；部分线粒体内可见EV71病毒颗粒。结论 EV71感染Vero细胞后在其胞质中增殖，并可侵入线粒体，导致线粒体直接损伤并致细胞死亡；线粒体是EV71在Vero细胞内的作用靶标。
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接种人用狂犬病疫苗致过敏性紫癜1例
患者女,30岁.因下腹部及双下肢散在淤点、淤斑13 d于2008-10-27入院.患者53 d前被犬咬伤左下肢,分别于咬伤当日、咬伤后第3、7、14、28日在右上臂三角肌肌内接种人用狂犬病疫苗(Vero细胞) (辽宁产,批号S20043089)0.5 mL.第5次接种后第12 d出现双下肢淤点、淤斑,呈对称性散在分布,无瘙痒感、关节痛.出现淤点、淤斑前无特殊食物进食史和用药史.
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人用狂犬病无佐剂纯化疫苗的安全性与免疫原性的初步观察
目的评价国产人用狂犬病无佐剂纯化疫苗(Vero细胞微载体)的安全性和免疫原性.方法对502人(A组)接种人用狂犬病无佐剂纯化疫苗(Vero细胞微载体)另100人(B组)作为对照接种巴斯德公司生产的狂犬病纯化疫苗.采用0、3、7、14和28天程序,观察每针次接种后72小时内局部和全身反应及14天、45天的免疫应答水平.结果所有接种对象均未出现严重局部和全身副反应.首剂免疫14天,A、B组抗体阳性率均达到100%,几何平均滴度为5.2IU/ml和5.6IU/ml.第45天,A组抗体几何平均滴度上升至9.5IU/ml1,与B组相似(9.8IU/ml).结论人用狂犬病无佐剂纯化疫苗(Vero细胞微载体)具有良好安全性和免疫原性.
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国产与进口冻干无佐剂人用狂犬病疫苗的安全性和免疫原性比较
目的 评价国产冻干人用无佐剂狂犬病纯化疫苗(Vero细胞)的安全性和免疫原性.方法 对600名健康人随机分为两组,480人(A组)接种冻干无佐剂人用狂犬病纯化疫苗(Vero细胞)和120人(B组)作为对照接种巴斯德公司生产的冻干无佐剂狂犬病纯化疫苗,采用0、3、7、14和28 天免疫程序.观察每针次接种后72小时内局部和全身反应及14天、45天的免疫应答水平.结果 所有接种对象均未出现严重局部和全身副反应.首剂免疫14天,A、B组抗体阳性率分别均达到98.06%和96.49%,几何平均滴度为5.0IU/ml和3.79 IU/ml.免疫后45天,A、B组抗体阳性率均达到100%,抗体几何平均滴度分别上升至7.97IU/ml和7.61IU/ml.结论 国产人用狂犬病无佐剂纯化疫苗(Vero细胞)具有良好安全性和免疫原性.
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样品浓度对VERO细胞狂犬病疫苗纯化效果的影响
接种疫苗可以有效防治狂犬病,但疫苗的纯度对防治效果具有决定性作用.基于此,本研究主要针对样品浓度和VERO细胞狂犬病疫苗纯化效果的相关性进行研究,结果显示样品浓度对杂蛋白去除率有明显的影响.样品浓度高于35 mg/ml时,狂犬病毒峰拖尾现,杂蛋白含量明显增加,纯化效果严重下降.因此,凝胶柱层析纯化狂犬病疫苗的样品浓度不能高于35mg/ml.
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哺乳动物初级精母细胞体外培养的研究
目的:探讨哺乳动物初级精母细胞体外培养分化的可能性.方法:制备雄性大鼠睾丸初级精母细胞,与非洲绿猴肾上皮细胞(Vero细胞)共培养,观察初级精母细胞体外培养过程中的生长行为,用5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)标记跟踪观察大鼠初级精母细胞在体外培养中的分化情况.结果:大鼠初级精母细胞与Vero细胞共培养后能进行减数分裂阶段分化,生成精子细胞;BrdU标记检测结果显示,培养前在体内标记BrdU的细胞为初级精母细胞,培养后在有BrdU标记的细胞中有早期精子细胞.结论:哺乳动物初级精母细胞在体外培养中能进行分化.
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狂犬病毒CTN-1株在Vero细胞中持续感染的特性研究
目的观察以Vero细胞大规模生产狂犬病毒时的细胞生长和病毒感染特性.方法以分种和混种方法,经过不同培养时间,测定Vero细胞的生长状况和胞内外病毒含量.结果细胞形态随接种病毒时间的长短有所变化,不同接种方法在病毒滴度也无显著性差异.培养上清夜病毒含量以第4～9d滴度高,细胞病毒感染率在第4d达80%以上,第10d后开始下降,第15d降入低谷.结论以0.01～0.10MOI的加毒比例,培养第4～9d收获效果佳.
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生物反应器培养Vero细胞的生长代谢与限制因素研究
目的研究生物反应器大规模培养Vero细胞生产疫苗细胞生长代谢与限制因素. 方法采用微载体培养系统进行细胞培养,同时进行细胞记数、消化和贴壁实验. 结果细胞培养过程中测得饱和溶解氧浓度系数(Cm)为0.197mM,体积氧解析系数(K1a)为0.0158min-1,同时随着葡萄糖消耗、乳酸生成,细胞停止生长并开始死亡. 结论利用生物反应器培养细胞时细胞代谢与细胞密度、搅拌速率、温度通气流量、葡萄糖消耗、乳酸生成等有直接关系.
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狂犬病固定毒aG株在Vero细胞上的传代适应研究
目的为研制安全,有效和使用方便的Vero细胞狂犬疫苗提供基础资料.方法对狂犬病固定毒3aG株在Vero细胞上的传代适应性进行了研究,同时进行了狂犬病毒在Vero细胞上繁殖适条件的选择实验.结果狂犬病固定毒3aG株在Vero细胞上多次传代后得到高滴度表达毒力可达8.3LogLD50/ml,具有较好的抗原性及免疫原性,并且确定了狂犬病病毒在Vero细胞上繁殖的适条件,即种毒量在0.1～0.01LD50/cell之间病毒滴度高.结论3aG-V毒株在Vero细胞上繁殖可维持相当长时间,并可进行多次加液,检测证实多次收获毒液毒力均达到疫苗制造要求.
关键词： 狂犬病固定毒3aG株 Vero细胞 传代 狂犬病疫苗 -
海南红树林淡紫拟青霉EPS纯化物体外抗HSV-1实验研究
目的:探讨海南红树林淡紫拟青霉胞外多糖(EPS)纯化物体外抗单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)活性,为开发新型抗病毒药物提供基础研究.方法:以Vero细胞为病毒感染靶细胞,以不同浓度EPS纯化物作用于HSV-1感染过程的各个阶段,以细胞病变程度(CPE)测定病毒半数感染量(TCID50),MTT法检测该纯化物对Vero细胞的毒性作用及对HSV-1的直接灭活作用、对病毒吸附和生物合成的影响.结果:EPS纯化物对Vero细胞无增殖作用,其半数有毒浓度(CC50)为735.49 μg/mL,纯化物在400 μg/mL以下时,细胞存活率达90％以上;在所用浓度范围内该纯化物可不同程度抑制病毒吸附,抑制率高达35.0％,与病毒对照组相比差异具有显著性(P＜0.01);该纯化物还具有抑制HSV-1生物合成作用,抑制率与药物浓度呈现出量效关系,其半数抑制浓度(IC50)为387.26 μg/mL,高抑制率达61.3％;在所用浓度范围内未发现该纯化物对HSV-1有直接灭活作用.结论:红树林来源的淡紫拟青霉EPS纯化物对Vero细胞毒性较小;该纯化物在一定浓度范围内可抑制HSV-1吸附和生物合成,且抑制生物合成作用较强,并表现出一定量效关系.
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应用生物反应器培养Vero细胞制备甲肝病毒
目的研究用生物反应器培养Vero细胞制备甲肝病毒W株的可行性.方法Vero细胞悬浮吸附HAV W株后,接种到搅拌式生物反应器中,用微载体进行培养,对营养物质、代谢产物及病毒的增殖进行分析.结果经四周的培养,病毒收获时,细胞密度达1.4×106/ml,甲肝病毒抗原滴度达1:64.结论W株已适应于Vero细胞中,用生物反应器培养产毒,有较好的应用前景.
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一种国产人用狂犬病疫苗(Vero细胞)的免疫原性与安全性评价
目的 评价一种国产人用狂犬病疫苗(Vero细胞)用于10～ 60岁健康人群的免疫原性和安全性.方法 单中心、随机、双盲、同类制品平行对照、模拟暴露后免疫的非劣效性研究.采用“Essen”免疫程序,选择10～60岁健康人群,按照1:1比例随机接种试验疫苗和对照疫苗,使用日记卡收集每针次接种后不良反应情况.采集免前、首针免后第14天和第42天血液标本,用快速荧光灶抑制试验(RFFIT)检测血清中狂犬病毒中和抗体水平.结果 试验组和对照组各入组600人.首针免后第42天和第14天,抗体阳转率均达到100％;抗体几何平均浓度(GMC)试验组为13.00IU/ml和7.89IU/ml,对照组为15.03IU/ml和10.20IU/ml,差异有统计学意义.总体征集性不良反应发生率试验组和对照组分别为60.33％和65.67％,差异无统计学意义.总体全身不良反应发生率对照组(46.17％)高于试验组(39.83％),前3针次不良反应发生率对照组(25.17％、16.13％、27.97％)均高于试验组(17.83％、11.80％、22.24％),差异有统计学意义.结论 长春卫尔赛生物药业有限公司研制的人用狂犬病疫苗(Vero细胞)在10 ～ 60岁健康人群中具有较好的免疫原性和安全性.
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三氯异氰脲酸灭活肠道病毒的试验研究
目的:研究三氰脲酸对肠道病毒的灭活作用.方法:用不同稀释度的三氯异氰脲酸抑制肠道病毒对Vero细胞的感染作用,48h后用MTT法测定细胞活性.结果:三氯异氰脲酸能明显抑制肠道病毒对Vero细胞的致病变作用(CPE),使细胞存活率升高.结论:该物质存在较显著的抗肠道病毒的作用,且对细胞的毒性很低,是一种及具推广应用前景的消毒剂.
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肠道病毒71型细胞感染灭活验证方法的建立
目的 建立肠道病毒71型细胞感染灭活验证的方法,为肠道病毒71型灭活疫苗的安全性提供技术保障.方法 将不同浓度的肠道病毒71型接种于五种不同细胞选择敏感性好的细胞,然后将制备的8批肠道病毒71型灭活样品接种在筛选到的敏感细胞上,35℃,5％ CO2连续培养21d,观察细胞病变情况.结果 Vero细胞感染法低能检测到1CCID 50/ml的肠道病毒71型,该方法检测8批肠道病毒71型灭活样品均为阴性.结论 本研究建立的肠道病毒71型细胞感染灭活验证方法具有良好的敏感性和重复性,可用于肠道病毒71型疫苗的灭活验证.
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H5N1流感疫苗株在Vero细胞中的研究
目的 产生在vero(非洲绿猴肾)细胞中能高适应生长的重配H5N1流感病毒疫苗株,并对其生物学特性进行初步测定.方法 修饰A/Puerto Rico/8/34(H1N1)(PR8)的NS基因为Vero细胞适应型,并合成NS基因片段,构建质粒pHW2000-NS;通过RT-PCR方法,扩增疫苗株A/Anhui/01/2005(H5N1)的HA、NA基因片段,构建质粒pHW2000-HA、pHW2000-NA;以PR8的其它5个内部基因作为骨架,按照1+2+5模式8质粒共转染Vero细胞拯救流感病毒,并对拯救病毒的生物学特性进行检测.结果 由Vero拯救出具有高适应生长特性的H5N1亚型人禽流感病毒疫苗株,并检测了重配疫苗株的生物学特性.结论 成功从Vero细胞拯救了具有Vero细胞高适应性生长特性的H5N1亚型人禽流感病毒疫苗株,为应用Vero细胞大规模生产流感疫苗奠定了基础.
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核黄素联合紫外线A照射对血浆中伪狂犬病毒的灭活效果
目的 考察核黄素联合紫外线A对血浆中伪狂犬病毒的灭活效果.方法 以伪狂犬病毒为模拟病毒,以Vero细胞为培养细胞,用病毒感染细胞,制备病毒增殖液;分别采用5、10、15及20J/cm2联合核黄素处理血浆,观察处理前后血浆病毒灭活的效果,筛选灭活病毒合适的紫外线剂量;将含有伪狂犬病毒血浆的样本分为实验组:采用上述筛选的紫外线强度照射联合核黄素处理;对照组1:单独采用紫外线A照射;对照组2:单独采用核黄素处理;阴性对照组:未采用紫外线照射和核黄素处理;分别在实验前后采用96孔细胞病变法,对照细胞病变效应,根据Reed-Muench公式计算病毒滴度.结果 采用不同强度的紫外线联合核黄素处理血浆,紫外线强度为15及20J/cm2的灭活血浆病毒的效果明显,处理后病毒滴度分别下降4.55和4.39 logs;实验组和对照组1病毒滴度分别下降4.55和4.28 logs,有统计学意义(P<0.05);对照组2病毒滴度降低1.93 logs,没有病毒灭活效果.结论 核黄素联合紫外线可灭活血浆中伪狂犬病毒,单独紫外线照射也具有灭活血浆伪狂犬病毒的效果;而仅单独采用核黄素处理而未联合紫外线照射,对血浆中伪狂犬病毒灭活效果不明显.
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肾综合征出血热双价纯化疫苗的研制
目的: 研制肾综合征出血热双价纯化疫苗.方法: 肾综合征出血热病毒I型LR1株和II型R22株分别在Vero细胞上接种培养.I、 II型病毒培养液依次经β-丙内酯灭活、超滤浓缩、蔗糖区带离心纯化及层析脱糖等处理.将检定合格的I、 II型单价病毒原液等量混合后, 用AI(OH)3佐剂吸附, 制备3批双价纯化疫苗.结果: 该3批疫苗已经自检和中国药品生物制品检定所复检合格, 并已进行临床试验.结论: 采用Vero细胞培养制备肾综合征出血热双价纯化疫苗方法可行.
