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HSF1/HSP70通路抑制c-Jun氨基末端激酶的活化保护UVA诱导的HaCaT细胞凋亡
目的 观察热休克转录因子1( HSF1)与热休克蛋白70( HSP70)对紫外线A(UVA)诱导HaCaT细胞凋亡的保护作用及其机制.方法 建立8mJ/cm2 UVA辐射损伤HaCaT细胞的病理模型.将细胞随机分为对照组、8mJ/cm2 UVA照射组、HSP70转录抑制剂组(50 μmol/L槲皮素).Honechst 33258荧光染色观察细胞凋亡；蛋白质印迹法检测UVA辐射HaCaT细胞后p-HSF1和HSP70蛋白的经时变化及UVA辐射后孵育6h JNK(c-Jun氨基末端激酶)、p-JNK的蛋白表达；Real-Time PCR检测HSP70 mRNA的表达.结果 UVA辐射后HaCaT细胞内p-HSF1、HSP70蛋白表达量均出现先增加后减少的时间依赖性趋势,其中p-HSF1于lh开始增加,3h达高峰,HSP70于6h达高峰,24h基本恢复原始水平；UVA辐射前预先加入HSP70转录抑制剂槲皮素能显著抑制HSP70 mRNA的表达,增加p-JNK的表达量,同时Honechst 33258荧光染色观察其与UVA辐射组比较凋亡率明显升高.结论 8mJ/cm2 UVA辐射HaCaT细胞在一定时间内可使HSF1活化致HSP70表达增加.HSFl/HSP70通路对UVA诱导的HaCaT细胞凋亡具有保护作用,其机制与HSP70大量表达后抑制JNK的活化有关.
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核黄素-紫外线诱导胶原交联治疗圆锥角膜
圆锥角膜是一种可严重影响视力的进行性眼病,其治疗方法有多种,但多数仅能治疗因圆锥角膜造成的屈光不正,并不能阻止圆锥角膜的发展.联合使用核黄素-紫外线A照射已成为目前惟一可以阻止圆锥角膜进展的治疗方法.核黄素-紫外线A联合可诱导角膜胶原发生交联,增大角膜胶原纤维直径,改善角膜硬度,并能提高对蛋白水解酶的耐受性,因此可以稳定角膜,阻止圆锥角膜进展;但应用过高能量的紫外线A照射也会导致角膜内皮细胞损伤及角膜细胞凋亡.临床应用的初步结果显示,该疗法可稳定圆锥角膜患者的屈光度及角膜形态,改善患者视力及角膜对称性,该方法安全、简便,不会影响患者眼压及角膜内皮细胞.有关该疗法的其他适应证、重复治疗及长期疗效等仍需进一步观察.
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紫外线A-核黄素诱导胶原交联临床应用进展
交联是聚合物工业中广泛使用的使材料变硬的一种方法,角膜组织主要由胶原组成.紫外线A-核黄素交联通过诱导角膜基质胶原分子之间的交联键增加其生物力学稳定性,主要应用于圆锥角膜的治疗,近年来对高度近视、角膜溃疡、屈光手术后的角膜扩张及大疱性角膜病变的治疗也取得一定的进展.
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紫外线对人角朊细胞的氧化损伤及防护研究
目的探讨紫外线A(UVA)对原代培养人皮肤角朊细胞的氧化损伤及防晒化妆品的防护效果.方法利用原代培养人皮肤角朊细胞,采用不同剂量的UVA照射,测定细胞上清液丙二醛,细胞内过氧化氢酶和超氧化物歧化酶,并对防晒化妆品的防护作用进行评价.结果 UVA照射剂量从2.88 J/cm2到11.52 J/cm2,MDA含量由2.54μmol/L增加到6.75 μmol/L,CAT含量由15.76 U/mg(prot)减少至6.33 U/mg(prot),SOD含量由25.55 NU/mg(prot)降至23.81 NU/mg(prot).涂抹广谱防晒化妆品后照射同样剂量的UVA,MDA由2.18μmol/L增至4.82μmol/L,CAT由17.19 U/mg(prot)减少至10.35 U/mg(prot),SOD由26.52 NU/mg(prot)降至24.51 NU/mg(prot).结论 UVA对人皮肤角朊细胞具有明显的氧化损伤作用,本实验条件下的广谱防晒化妆品对细胞具有一定的防护功能.
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光毒性试验方法研究
目的探讨采用单纯紫外线A(UVA)为照射光源的光毒性试验的影响因素及试验条件.方法观察了照射强度随照射时间的变化及照射时间对照射野内温度的影响.选择健康成年白化豚鼠,以10 J/cm2剂量UVA照射50 min观察阳性对照8-甲氧基补骨脂(8-MOP)的皮肤光毒性.结果照射开始后100 min内光强度稳定在3.3～3 4 mW/cm2,室温18℃时照射100 min后照射野内温度上升1.5℃,8-MOP具有明显皮肤光毒性.结论该方法可准确测定化学物质的光毒性.具有良好的科学性和可行性.
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姜黄素抑制转录因子-κB信号通路影响基质金属蛋白酶在胬肉上皮细胞的表达
目的 紫外线辐射能够引起基质金属蛋白(MMPs)在翼状胬肉上皮细胞中的表达增加.探讨姜黄素对紫外线A(UVA)照射后人胬肉成纤维细胞MMP-2和MMP-9表达的影响以及可能机制.方法 在优选UVA照射剂量和姜黄素浓度后,将第2代细胞人胬肉成纤维细胞分为对照组(不照射UVA、不加药物)、UVA组(暴露于UVA下)及UVA+姜黄素组(暴露UVA下加姜黄素30μmol/L,100μL).明胶酶谱法检测培养液中MMP-2和MMP-9含量;RT-PCR检测细胞MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA水平;凝胶迁徙电泳检测细胞核转录因子-κB的活化.结果 与对照组相比,UVA照射后,人胬肉成纤维细胞培养基中MMP-2和MMP-9含量均显著增加(P<0.05);UVA+姜黄素组较UVA组明显减少(P<0.05).与对照组相比,UVA组MMP-9 mRNA表达明显增加[(100±0)％vs(247.0±10.8)％,P<0.05];UVA+姜黄素组较UVA组明显降低[(88.7±5.1)％vs(247.0±10.8)％,P<0.05].与对照组相比,UVA组NF-κB表达显著增加(P<0.05),UVA+姜黄素组较UVA组明显减少(P<0.05).结论 姜黄素可能通过抑制细胞NF-κB的活化来抑制MMP-2和MMP-9的表达.
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扇贝多肽经由EGFR-CDK-4通路抑制UVA诱导的HaCaT细胞凋亡
目的 建立8 J.cm~(-2)紫外线A(UVA)辐射损伤永生化的人角质形成细胞株(HaCaT)细胞的病理模型,经由信号通路的表皮生长因子受体(EGFR),磷脂酰肌醇-3 激酶(AKT),细胞周期蛋白(CyclinD_1)至周期蛋白依赖激酶4(CDK-4)角度研究扇贝多肽(Polypeptide from Chlamys farreri,PCF)抑制UVA诱导HaCaT细胞凋亡的分子机制.方法 采用琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡;RT-PCR和DNA测序法检测胞内表皮生长因子受体EGFR的mRNA表达及基因变化;蛋白印迹法检测AKT,p-AKT,CyclinD_1及CDK-4的蛋白表达水平.结果 EGFR抑制剂AG1478和AKT抑制剂PHZ1023均可阻断UVA引起的细胞凋亡;1.42～5.68mmol·L~(-1)范围内的PCF可抑制UVA辐射后细胞内EGFR的表达量.预先加入AG1478和PHZ1023则分别抑制UVA引起的AKT及CyclinD_1,CDK-4蛋白水平的表达.结论 PCF可以通过阻断EGFR-CDK-4通路来抑制UVA诱导的HaCaT细胞凋亡.
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姜黄素对核转录因子-κB表达的影响及小鼠角膜紫外线照射损伤的抑制作用
目的 探讨姜黄素对紫外线A(ultraviolet A,UVA)照射小鼠角膜损伤的抑制作用.方法 取C57 BL/6小鼠30只,随机分为3组,每组各10只;UVA照射组双眼接受位于前上方的UVA照射,波长为320 ～400 nm,照射强度为0.05 W· cm-2,照射距离固定,照射时间24 h.姜黄素干预组在UVA照射前3d给予小鼠姜黄素30 mg·kg-1腹腔内注射,并持续至照射后48 h.对照组不做任何处理.利用裂隙灯观察角膜病变并对角膜混浊进行分级;照射后48 h取小鼠角膜组织,使用电泳迁移率实验检测核转录因子-κB (nuclear factor-κB,NF-κB)的表达.结果 照射后48 h,UVA照射组角膜混浊临床评分(3.10±0.74)均高于对照组(0)及姜黄素干预组(0.35±0.24).两两比较发现对照组与姜黄素干预组间角膜混浊临床评分差异无统计学意义(P ＞0.05);UVA照射组与对照组以及姜黄素干预组间差异均有统计学意义(均为P ＜0.05).照射后48 h,角膜组织NF-κB表达水平对照组(1.25±0.13)与姜黄素干预组(1.58±0.34)均较低,UVA照射组(3.98±0.58)明显升高.两两比较发现对照组与姜黄素干预组角膜组织NF-κB表达水平差异无统计学意义(P ＞0.05);UVA照射组与对照组以及姜黄素干预组间差异均有统计学意义(均为P＜0.05).结论 姜黄素可以减轻UVA照射对小鼠角膜造成的损伤,其作用可能是通过抑制角膜组织内NF-κB表达实现的.
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微创核黄素-紫外线A巩膜胶原交联对巩膜生物力学强度的增强作用及安全性
目的 研究微创核黄素-紫外线A行巩膜胶原交联后巩膜生物力学特性的改变及其安全性.方法 采用计算机取随机数法将56只清洁级新西兰大白兔随机分为非交联对照组和交联后1d、7d、15 d、1个月、2个月和3个月组,每组8只,其中6只用于巩膜生物力学性能检测,2只分别用于组织病理学检查和细胞凋亡检测.各组兔均取右眼为实验眼,左眼为正常对照眼.兔实验眼以质量分数0.1％核黄素溶液(不含右旋糖酐)作为光敏感剂点眼,1次/2 min,共10次,然后制作微创结膜切口,微创紫外线巩膜交联仪发光二极管(LED)端插入并贴近眼球后部巩膜照射30 min,紫外线波长为370 nm,辐照度为3 mW/cm2.照射期间用医用体温计测量巩膜温度;按照分组时间点获取实验兔球壁组织,采用千分尺测定巩膜厚度;采用微材料力学性能测试系统对巩膜条带行预拉伸、拉伸破坏试验,测定巩膜的极限应力、极限应变和8％弹性模量;制备兔眼球组织切片并行苏木精-伊红染色,评估眼球组织病理学变化;采用TUNEL法检测视网膜细胞凋亡情况. 结果 非交联对照组和交联后1d、7d、15d、1个月、2个月和3个月组实验兔及其左右眼间巩膜厚度的总体比较差异均无统计学意义(F眼别=0.02,P＞0.05;F组别 =1.71,P＞0.05).与非交联对照组比较,兔右眼交联后1d、7d、15 d、1个月、2个月和3个月组巩膜极限应力和8％弹性模量均明显增加,极限应变均明显下降,差异均有统计学意义(均P＜0.05),与交联后1d、7d、15d、1个月和2个月组比较,交联后3个月组实验眼极限应力、8％弹性模量值均下降,极限应变均增加,差异均有统计学意义(均P＜0.05);与非交联的左眼比较,交联后各时间点右眼极限应力、8％弹性模量值均增加,极限应变均下降,差异均有统计学意义(均P＜0.05).组织病理学检查显示,交联后实验兔眼角膜、巩膜、虹膜、睫状体和脉络膜组织均无明显病理学改变.细胞凋亡检测结果显示,非交联对照组和交联后1d、7d、15d、1个月、2个月和3个月组实验眼视网膜细胞凋亡率分别为(11.00±0.33)％、(12.33±1.58)％、(12.02±0.45)％、(11.81±0.85)％、(12.15±0.61)％、(12.14±0.25)％和(11.74±0.63)％,组间总体比较差异无统计学意义(F=1.78,P=0.14).结论 微创核黄素-紫外线A巩膜胶原交联术可有效增强兔巩膜的生物力学强度,且对眼球各组织无明显病理性损害.
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核黄素-紫外线A照射加速巩膜交联治疗豚鼠实验性近视
目的 评估口服核黄素联合脉冲和持续紫外线A(UVA)照射加速巩膜交联对实验性豚鼠进展性近视的治疗作用以及对巩膜生物力学和组织学改变作用. 方法 30只4周龄豚鼠按照随机数字表法分为空白对照组、非交联组、传统交联组、脉冲光加速交联组和持续光加速交联组,每组均为6只.3个组巩膜交联组豚鼠均连续服用核黄素和维生素C3d后,进行右眼近视眼建模和UVA照射.照射参数分别为传统交联组波长370 nm,功率为0.67 mW/cm2,连续照射1h;脉冲光加速交联组波长370 nm,功率为10 mW/cm2,共照射8 min,脉冲模式为1 s开/1 s关;持续光加速交联组波长370 m,功率为10 mW/cm2,连续照射4 min.非交联组仅接受右眼近视眼建模,但未服用核黄素及维生素C,也不接受UVA照射;空白对照组不接受任何处理.分别测量5个组基线及建模后的屈光度和眼轴长度.2周后颈椎脱臼法处死豚鼠,摘除右眼行巩膜生物力学和组织病理学检查.结果 实验2周后,与空白对照组相比较,非交联组眼轴明显伸长,近视屈光度明显增加,巩膜大载荷及大应力显著下降,巩膜胶原纤维粗细不均匀,部分溶解,巩膜Collagen 1 A及TIMP-2阳性染色减少,MMP2阳性染色增加,提示近视造模成功.传统交联组、脉冲光加速交联组和持续光加速交联组,交联组豚鼠眼球眼轴长度短于非交联组,和近视屈光度明显高于非交联组,差异均有统计学意义(均P＜0.01);3个交联组豚鼠眼球大载荷值及大应力值均高于非交联组[大应力:(2.20±0.03)、(2.67±0.05)、(2.41±0.04) Mpa vs.(1.30±0.02) Mpa;大载荷:(1.93±0.03)、(2.33±0.28)和(1.91±0.03)P vs.(1.54±0.06)P],差异均有统计学意义(均P＜0.01);巩膜组织病理学检查显示脉冲光加速交联组和持续光加速交联组巩膜胶原纤维粗细均匀,更接近空白对照组巩膜形态.免疫组织化学染色显示,与非交联组比较,3个组交联组巩膜Collagen1A阳性染色均增多,脉冲光加速交联组和持续光加速交联组MMP2阳性染色减少及TIMp-2阳性染色增加.结论 口服核黄素联合脉冲和持续UVA照射加速巩膜交联可以通过增强巩膜生物力学强度,有效地阻止豚鼠实验性近视的进展.
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核黄素联合紫外线A照射对血浆中伪狂犬病毒的灭活效果
目的 考察核黄素联合紫外线A对血浆中伪狂犬病毒的灭活效果.方法 以伪狂犬病毒为模拟病毒,以Vero细胞为培养细胞,用病毒感染细胞,制备病毒增殖液;分别采用5、10、15及20J/cm2联合核黄素处理血浆,观察处理前后血浆病毒灭活的效果,筛选灭活病毒合适的紫外线剂量;将含有伪狂犬病毒血浆的样本分为实验组:采用上述筛选的紫外线强度照射联合核黄素处理;对照组1:单独采用紫外线A照射;对照组2:单独采用核黄素处理;阴性对照组:未采用紫外线照射和核黄素处理;分别在实验前后采用96孔细胞病变法,对照细胞病变效应,根据Reed-Muench公式计算病毒滴度.结果 采用不同强度的紫外线联合核黄素处理血浆,紫外线强度为15及20J/cm2的灭活血浆病毒的效果明显,处理后病毒滴度分别下降4.55和4.39 logs;实验组和对照组1病毒滴度分别下降4.55和4.28 logs,有统计学意义(P<0.05);对照组2病毒滴度降低1.93 logs,没有病毒灭活效果.结论 核黄素联合紫外线可灭活血浆中伪狂犬病毒,单独紫外线照射也具有灭活血浆伪狂犬病毒的效果;而仅单独采用核黄素处理而未联合紫外线照射,对血浆中伪狂犬病毒灭活效果不明显.
