首页 > 文献资料
-
我国新分离森林脑炎病毒E基因特征分析
为了解分离自黑龙江省大兴安岭林区全沟硬蜱中的DXAL-5、12、13、16、18,21共6株森林脑炎(TBE)病毒E蛋白基因特征并确定病毒基因型,应用RT-PCR技术对6株病毒E蛋白基因进行体外扩增、克隆、测序.结果发现,6株病毒E蛋白基因的核苷酸序列长均为1 488 bp,推导的氨基酸序列长均为496 aa.与TBE参考毒株E蛋白基因进行比较,这6株病毒与远东亚型同源性高,其次是西伯利亚亚型,与欧洲亚型同源性差;在决定亚型特征的氨基酸位点多数属于TBE病毒远东亚型.E蛋白基因推导的氨基酸种系发生树分析表明,6株病毒均在远东亚型分枝内.因此就E蛋白基因而言,DXAL-5、12、13、16、18、21株均属于TBE病毒的远东亚型.新分离毒株与Senzhang株同源性较高,种系发生关系也比较接近,推测疫苗株对新分离毒株仍具有很好的保护作用.但是在E蛋白的A、B和C抗原决定区内,6株病毒均有不同程度的氨基酸改变,这些突变有可能影响E蛋白的功能.
-
乙型脑炎病毒E蛋白基因真核表达载体pEGFP-C1-JEV的构建及在BHK-21细胞中表达
目的 构建乙脑病毒E蛋白基因片段的真核表达载体pEGFP-C1-JEV,旨在研究E蛋白基因在BHK-21细胞中的瞬时表达情况,为进一步深入研究提供基础资料.方法 通过RT-PCR扩增目的基因,酶切并重组后成功构建绿色荧光蛋白标记的pEGFP-C1-JEV重组表达载体,利用脂质体介导将重组质粒转染BHK-21细胞,观察绿色荧光标记蛋白表达情况,同时提取细胞RNA,检查目的基因转录表达情况,并利用免疫组化和Western blot法检测目的基因表达情况、表达蛋白在细胞中的定位以及表达蛋白抗原性.结果 重组质粒pEGFP-C1-JEV构建成功,转染至BHK-21细胞中,绿色荧光标记蛋白正常表达,表达率较高,RT-PCR表明目的基因在BHK-21正常转录并表达,表达蛋白主要分布在BHK-21细胞的胞质和包膜中,且能与豚鼠抗JEV抗体特异性结合.结论 pEGFP-C1-JEV质粒在BHK-21细胞中正常表达,且对细胞生长和形态不产生影响,真核表达抗原具有良好的抗原性,本研究可为进一步探讨乙型脑炎E蛋白基因体外真核表达及其功能和应用的研究提供基础资料.
-
HCV E蛋白基因的变异及变异的意义
目的 分析不同来源HCV的不同亚型(不同型别之间的不同亚型)及同一亚型之间E蛋白基因的变异及变异的意义.方法 使用GenBank公开发表的不同来源HCV的不同亚型及同一亚型之间全基因序列为材料,用CLustalw2软件分析序列之间的同源性.结果 不同亚型之间E蛋白基因变异达到了70.5%(E1蛋白基因)和59.8%(E2蛋白基因);不同亚型的E2蛋白基因有两个高度变异区,相同的亚型之间只有一个高变区;伺一亚型之间E蛋白基因的变异率为11.8%～16.8%(E1蛋白基因)和18.4～29.9%(E2蛋白基因).结论 根据相同亚型之间E蛋白基因的变异较小的特点,可以利用不同亚型病毒的抗原表位发展多价混合多肽疫苗或多基因混合疫苗,可能会对多种不同亚型病毒的感染起到免疫保护作用.
-
乙脑病毒减毒株SA14-14-2在原代地鼠肾细胞多次传代后病毒基因稳定性研究
目的研究乙脑病毒减毒株SA14-14-2在原代地鼠肾细胞(PHKC)传代后E蛋白基因的稳定性.方法将乙脑病毒(JEV)减毒株SA14-14-2在原代地鼠肾细胞上传至20代,分析第1代(JEVPHKC P1)、第5代(JEVPH-KCP5)、第10代(JEVPHKC P10)、第15代(JEVPHKC P15)、第20代(JEVPHKC P20)的E蛋白基因的核苷酸序列,并与Genbank的乙脑病毒减毒株(D90195)比较.结果RT-PCR扩增出的乙脑病毒减毒株E蛋白基因片段大小为1 500bp,与Genbank库中乙脑病毒弱毒株SA14-14-2核苷酸、氨基酸序列比较显示,JEVPHKC P1,P5,P10病毒与GenbankD90195 E蛋白核苷酸和氨基酸完全相同,P15,P20与E425位点核苷酸和E142位点的氨基酸有不同,同源性分别为99.93%和99.8%.结论乙脑病毒减毒株SA14-14-2的遗传学特性稳定,从分子水平证明了乙脑减毒活疫苗的安全性.
-
乙型脑炎减毒活疫苗E蛋白基因及氨基酸序列稳定性分析
目的 分析2003～2011年连续9年出口韩国的23批乙型脑炎减毒活疫苗E蛋白基因及氨基酸序列的稳定性.方法 提取出口韩国的23批乙型脑炎减毒活疫苗及其生产该疫苗的主种子和工作种子病毒RNA,RT-PCR法扩增乙型脑炎减毒活疫苗病毒E蛋白基因片段后进行测序;将23批乙型脑炎减毒活疫苗E蛋白基因序列中8个关键位点氨基酸序列与GenBank中登录的乙型脑炎病毒弱毒株SA14-14-2应用AlignX比对软件进行分析;检测23批乙型脑炎减毒活疫苗及生产该疫苗的主种子和工作种子病毒滴度.结果 23批疫苗与生产该疫苗的主种子、工作种子的病毒E蛋白基因序列与GenBank中登录的乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2 E蛋白基因序列完全一致,均由1 500个核苷酸组成,并编码500个氨基酸,同源性100％; 23批疫苗E蛋白基因中与弱毒力密切相关的8个关键位点的氨基酸均未发生改变,与生产该疫苗的主种子、工作种子以及GenBank中登录的乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2(D90195)E蛋白相应位点一致性为100％;生产23批疫苗的主种子和工作种子病毒滴度变化幅度较小,为6.72～7.17 lgPFU/ml,而23批疫苗的病毒滴度变化幅度也较小,为7.02 ～7.61 lgPFU/ml.结论 连续9年出口韩国的23批乙型脑炎减毒活疫苗病毒E蛋白基因稳定,一致性良好,该疫苗质量稳定,安全可靠.
-
流行性乙型脑炎病毒SA14-14-2株E蛋白基因在原核细胞中的高效表达及其表达产物的抗原性分析
目的获得JEV E蛋白基因并使其在E.coli中高效表达,以研究其抗原活性,为进一步研制ELISA早期诊断试剂盒奠定基础.方法根据已发表的JEV SA-14-14-2减毒株序列,设计一对特异性引物,通过RT-PCR扩增出E蛋白基因的cDNA片段,并将其克隆入pET-32a(+)表达载体中,构建重组融合表达载体pET-E,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,利用IPTG诱导获得高效表达.结果扩增的E蛋白基因片段长1113bp,编码371个氨基酸残基,该基因片段与国内发表的减毒株SA14-14-2碱基序列同源性为100%.表达产物分子量约为62kD,经Western blotting分析表明表达产物具有较好的抗原性.结论通过序列分析表明,我国的JEV SA-14-14-2减毒株未发生基因突变.表达产物的稳定高效表达及其抗原特异性分析为今后ELISA早期诊断试剂盒的研制提供了依据.
-
流行性乙型脑炎病毒E蛋白基因在大肠杆菌中的克隆与表达
目的;获得JEV E蛋白基因,构建重组表达载体并在E.coli中高效表达.方法:参照GeneBank中的日本乙型脑炎病毒SA14-14株序列设计一对特异性引物,采用RT-PCR法扩增E基因全长,克隆至PUCm-T载体,经测序证实后克隆至原核表达载体pET32a中,转化入BL21(DE3),IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析.结果:限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,扩增出了JEV E蛋白基因全长1500bp,成功构建了重组质粒pET-32a/JEV E,SDS-PAGE分析显示目的蛋白主要以包涵体的形式在大肠杆菌中获得表达,表达量占总菌体蛋白的35%.结论:在大肠杆菌中成功表达了JEV E蛋白,为ELISA早期诊断试剂盒的研制和E蛋白基因结构与功能的分析奠定了基础.
关键词： 流行性乙型脑炎病毒 E蛋白基因 反转录-聚合酶链反应 基因克隆 表达载体
