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位点特异性重组技术及其在寄生虫学研究中的应用
位点特异性重组是一种高效、准确地对目地基因进行遗传学操作的技术.位点特异性重组系统包括特异性重组酶及特异性位点.本文就位点特异性重组技术的原理及其在寄生虫学研究中的应用做一综述.
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基因克隆技术及其进展
基因克隆技术，又称重组 DNA技术，是将目的基因与具有自主复制能力的载体 DNA进行体外重组，获得新的重组 DNA后导入受体细胞中表达相应蛋白，以研究蛋白结构与功能及其与其他分子的相互作用。近，随着非编码 RNA的发现，这项技术也用于 RNA的研究。基因克隆技术从发明到现在经历了三个发展阶段。第一个阶段是20世纪70年代初经典的基因克隆技术的创建[1-2]。经典的基因克隆技术是需要限制性内切酶和连接酶的克隆方法，至今仍被广泛应用。第二个阶段是20世纪90年代初不依赖连接酶的克隆方法的出现[3]。这种方法不需要连接酶的参与，不受限制性内切酶的限制，使得基因克隆更加灵活。第三个阶段是21世纪初将重组酶运用到基因克隆中[4]，使基因克隆更加强大，靶向性更强，操作更简便。本综述从基因克隆技术发展的这三个阶段入手，概述各项方法的原理和特点，方便人们根据自己的需求选择合适的基因克隆方法。
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重组酶在胰岛素生产中的应用
本文分别测定了重组的与天然的牛胰蛋白酶和羧肽酶B对前胰岛素融合蛋白的裂解活性.水解产物采用HPLC进行分析,发现重组酶具有更强的活性并且副产物少,因此重组酶在胰岛素生产中比天然的牛胰蛋白酶和羧肽酶B具有更好的前景.
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单纯疱疹病毒Ⅰ型基因治疗载体的快速构建
背景:单纯疱疹病毒Ⅰ型载体因具有独特的优点目前被广泛应用,但其构建尚缺乏一种快速有效的方法.目的:利用Cre/Loxp 高效重组系统构建单纯疱疹病毒Ⅰ型载体.方法:分离单纯疱疹病毒HSV-1,将含Cre 重组酶的c66-SV40-cre 质粒转染Vero 细胞,构建一株带有Loxp 位点的重组HSV-1 框架载体HSVLoxp.构建穿梭载体pShuttle- SV40-Cre-Loxp-IRES 及重组单纯疱疹病毒Ⅰ型载体HSV-GDNF,用HAT 培养基筛选出阳性毒株后用GDNF 引物做PCR 鉴定,扩增培养后测定滴度.结果与结论:成功构建pHV-TK-GFP 质粒,并在Vero细胞内发生重组,分离出缺失了Us3基因的重组病毒HSVtk-Loxp-GFP01.成功构建HSV-1 框架载体HSVLoxp 及穿梭载体pShuttle-SV40-Cre-Loxp-IRES,成功获得GDNF 基因,并将其转移到了HSV-1 基因组上,成功构建了表达GDNF 的单纯疱疹病毒HSV-1 载体,测定其滴度约为2.25×106 IU/mL.
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ccr重组酶基因介导SCCmec基因岛的剪切功能研究
目的 构建携带ccrC和ccrAB重组酶基因的载体质粒,并导入耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)中,验证ccrC重组酶具有把Ⅴ型SCCmec基因岛从细菌染色体上特异性剪切下来的功能.方法 以携带Ⅴ型SCCmee基因岛的菌株81/0342的染色体DNA为模板,应用PCR法扩增ccrC基因,再以携带Ⅱ型SCCmec基因岛的菌株N315的染色体DNA为模板,应用PCR法扩增ccrAB基因,分别克隆到温度敏感质粒pYT3上构建重组质粒pSRSC和pSR2AB,电穿孔技术交又导入原野生菌株81/0342和N315中构建6株细菌转化株,在适宜温度培育下充分表达质粒,应用PCR法检测SCCmec基因岛从染色体上脱落,并连续10 d传代培养细菌,应用影印实验检查细菌的药物敏感性变化.结果 ccrC重组酶基因的PCR扩增产物为1.9 kb,小于Ⅱ型SCCmec基因岛上携带的ccrAB重组酶基因.经鉴定证实成功构建了重组质粒pSR5C和pSR2AB,当菌株81/0342中导入重组质粒pSR5C和pSR2AB后,81/0342所携带的Ⅴ型SCCmec基因岛能从染色体上剪切下来,并以环状DNA结构存在于细菌中,而只有当N315中导入重组质粒pSR2AB时,N315所携带的Ⅱ型SCCmec基因岛才能脱落下来,SCCmec基因岛脱落的细菌成为对妥布霉素和头孢唑肟药物敏感的菌株.结论 ccrC重组酶与ccrAB一样具有特异性剪切酶的功能,可单独介导Ⅴ型SCCmec基因岛的脱落,从而为社区MRSA所携带的Ⅴ型SCCmec基因岛在金黄色葡萄球菌之间的广泛传播提供了实验依据.
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高迁移率族蛋白B1及其信号分子作用研究进展
HMGB1是HMGB亚家族成员之一.早期研究显示,HMGB1是一种DNA结合蛋白,通过与多种转录因子、复制蛋白、甾体受体及RAG1重组酶作用,参与DNA重组、修复、基因转录调控,细胞复制和分化成熟等多种生命活动[1].
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Cre/loxP系统与时空特异性基因打靶
时空特异性基因打靶是指借助于噬菌体P1的位点特异性重组酶Cre和该酶的特定作用位点loxP组成的Cre/loxP系统的作用、利用控制Cre表达的启动子的时空特异性,从而在特定的发育阶段和特定的组织细胞中对特定的基因进行遗传修饰的技术.本文主要介绍该技术的一般原理和方法.
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重组酶介导的日本血吸虫特异性基因片段核酸等温扩增检测方法的建立
目的 建立一种可用于日本血吸虫特异性基因片段检测的重组酶介导的核酸等温扩增方法(RAA).方法 以日本血吸虫SjG28基因片段作为靶序列,根据RAA反应原理设计合成引物,建立并优化RAA反应体系.应用此方法与聚合酶链式反应(PCR)同时扩增梯度稀释的含不同拷贝数的SjG28基因片段TA克隆质粒及不同浓度的基因组DNA,以评价其敏感性;应用此方法检测曼氏血吸虫、似蚓蛔线虫、十二指肠钩口线虫基因组DNA及健康人血基因组DNA,以评价其特异性.结果 建立的RAA法可特异性扩增日本血吸虫中国大陆株成虫及虫卵基因组DNA,反应可在30 min内完成.以重组质粒为模板,RAA法低可检出的质粒拷贝数为20个/μL;以基因组DNA为模板,RAA法低可检测浓度为0.01 ng/μL.建立的RAA法以健康人全血基因组DNA及曼氏血吸虫成虫、似蚓蛔线虫、十二指肠钩口线虫基因组DNA为模板的扩增结果均为阴性.结论 本研究建立了一种反应快捷、敏感性和特异性均较高的RAA方法,其具有应用于日本血吸虫病基因诊断的价值.
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细胞谱系示踪技术及其在口腔医学研究中的应用进展
细胞谱系示踪技术对研究生物体生长发育、组织新陈代谢与疾病发生时各种细胞的起源、发生发展与转归十分重要,尤其在探索各种干细胞的谱系以及成熟细胞的前体来源细胞中应用广泛.细胞谱系示踪技术方法众多,且每一种技术都有其使用的范围、优势、原则和不足,本文就不同细胞示踪技术的发展与应用,尤其是在口腔医学研究中的应用,以及各自优势与不足进行综述.
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葛根素对细胞色素P450酶活性的影响
目的 研究葛根素体外对细胞色素P450酶1a2(CYP1A2)、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4活性的影响.方法 分别以咖啡因、甲苯磺丁脲、美芬妥因、美托洛尔和咪达唑仑为探针药,利用高效液相色谱法测定探针药与相应代谢产物的浓度,采用重组酶研究葛根素对CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4酶活性的影响.结果 在体外重组酶反应体系中,葛根素对CYP2C9、CYP2C19及CYP3A4酶活性无明显影响.但低浓度葛根素(0.1 mmol·L-1)使CYP1A2的活性降低(48±9)%(P＜0.05),CYP2D6的活性降低(61±8)%(P＜0.01);高浓度(0.4mmol·L-1)使CYP1A2的活性降低(82±8)%(P＜0.01),CYP2D6的活性降低(88±6)%(P＜0.01).结论 葛根素(0.1 mmol·L-1)对CYPlA2和CYP2D6酶活性有较明显的体外抑制作用;且随着葛根素浓度的增高,对这两种酶活性的抑制作用也增强.为研究葛根素与其他药物的相互作用及作用机制等奠定了基础.
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葛根素对5种细胞色素P450酶体外活性影响研究
目的 研究葛根素体外对细胞色素P450酶亚型CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4等活性的影响.方法 分别以咖啡因、甲苯磺丁脲、美芬妥因、美托洛尔和咪哒唑仑为探针药,采用高效液相色谱法测定探针药与相应代谢产物的浓度,采用重组酶研究葛根素对CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4酶体外活性的影响.结果 在体外重组酶反应体系中,葛根素对CYP2C9、CYP2C19及CYP3A4酶活性无明显影响.但低浓度(0.1mmol·L-1)下可使CYP1A2活性降低(48±9)%(P＜0.05),使CYP2D6活性降低(61±8)%(P＜0.01);高浓度(0.4mmol·L-1)下使CYP1A2活性降低(82±8)%(P＜0.01),使CYP2D6活性降低(88±6)%(P＜0.01).结论 葛根素对CYP1A2和CYP2D6酶体外活性有较明显的抑制作用;随着葛根素浓度的增高,抑制作用也相应增强.
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Brec1重组酶治疗艾滋病动物实验成功
近日，Karpinski等开发出一种利用重组酶治疗艾滋病的新疗法，有望帮助患者从体内清除HIV病毒。目前该疗法动物实验已获得成功，且已获准下一步在艾滋病患者身上进行初步的临床试验。该研究于2016年2月22日在《Nature Biotechnology》上在线发表。
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Su11248对人重组P450同工酶的体外抑制实验研究
目的：通过体外实验探讨SU-11248对CYP3A4、CYP2C9和CYP2D6酶活性的影响,为其在临床与其他药物的联合应用提供实验依据和理论指导。方法采用BD公司的人重组P450酶抑制剂筛选试剂盒,测定Su11248对上述三种P450同工酶的体外活性抑制50%的药物浓度(IC50)。结果 SU-11248对CYP3A4的IC50=11.85μM,对CYP2C9的IC50=7.74μM,对CYP2D6的IC50>50μM。结论 Su11248对CYP2C9酶活性有中等程度的抑制作用,对CYP3A4和CYP2D6酶活性无明显抑制作用。
关键词： SU11248 重组酶 细胞色素P450同工酶 药物-药物相互作用
