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位点特异性重组技术及其在寄生虫学研究中的应用
位点特异性重组是一种高效、准确地对目地基因进行遗传学操作的技术.位点特异性重组系统包括特异性重组酶及特异性位点.本文就位点特异性重组技术的原理及其在寄生虫学研究中的应用做一综述.
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放线菌噬菌体重组酶Sre在大肠杆菌内高效介导位点特异性重组
目的证明放线菌噬菌体重组酶Sre在大肠杆菌细胞内介导高效的位点特异性重组. 方法在大肠杆菌内构建分子内重组分析系统.质粒pBZP含有方向相同的attB和attP位点,分别位于lacZ基因的两侧.将pBZP电击导入含有sre基因的大肠杆菌细胞. 结果重组的发生导致lacZ基因的切除,使含有X-Gal成分的培养基上细菌菌落从蓝色变成白色.整合后DNA经酶切、PCR和DNA测序证实.发生100%重组率的attB和attP小片段分别是50 bp和47 bp. 结论在大肠杆菌宿主环境中放线菌噬菌体重组酶Sre高效催化位点特异性重组.本分子内重组分析系统是一个简便而有效的方法.
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重组人凝血因子Ⅶ在Flp-In-CHO细胞中的表达及鉴定
目的 利用Flp/FRT位点特异性重组技术,在Flp-In-CHO细胞中表达重组人凝血因子Ⅶ(rhFⅦ),并进行鉴定.方法 用限制性内切酶EcoR Ⅰ和EcoR Ⅴ分别双酶切质粒pT-FⅦ与表达载体pcDNA5/FRT/TO,将回收的目的基因片段和载体片段连接,构建重组表达质粒pcDNA5/FRT/TO-FⅦ,并与辅助质粒pOG44共转染Flp-In-CHO细胞,经400 μg/ml潮霉素B压力筛选,获得抗性细胞株.采用PCR、RT-PCR、Western blot和PT等方法对筛选出的细胞株分别进行基因组水平、mRNA水平、表达水平和蛋白活性的鉴定.结果 重组表达质粒pcDNA5/FRT/TO-FⅦ经PCR、双酶切及测序鉴定证明构建正确;筛选出9株抗性细胞;外源基因FⅦ定点整合到Flp-In-CHO细胞基因组中并得到表达;重组蛋白表现出与血浆FⅦ相一致的促凝活性.结论 利用位点特异性表达系统Flp/FRT,在Flp-In-CHO细胞中成功表达了hFⅦ,为其制备和纯化奠定了基础.
关键词: 人凝血因子Ⅶ 位点特异性重组 Flp-In-CHO细胞 -
φC31位点特异性整合酶系统在生物医学上的应用
理想的基因转移系统是成功实现基因治疗的关键因素.噬菌体φC31位点特异性整合酶体系集有效性和安全性于一体,通过介导特异性识别位点间的同源重组反应,将外源基因整合到基因组中,使转基因的表达达到持续、高效的目的,为非病毒载体转移系统在遗传病基因治疗上的应用开辟了新的途径.
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应用微环DNA技术体外诱导和制备重组的乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)是病毒慢性感染的分子基础.本课题组前期研究通过Cre/loxP介导的位点特异性DNA重组策略,在细胞核内由前体质粒诱导重组cccDNA(rcccDNAloxP)产生,首次建立了HBV cccDNA的体外培养细胞和小鼠实验模型.本研究基于大肠埃希菌ZYCY10P3S2T PhiC31重组酶诱导表达系统,建立了一种体外诱导HBV rcccDNA(rcccDNAattR)微环产生和纯化的策略.纯化的rcccDNAattR微环具有超螺旋结构,细胞培养实验证实其能支持功能性的HBV复制和抗原表达.与普通的线性HBV复制子编码质粒相比,rcccDNAattR尾静脉高压注射小鼠模型能诱导显著延长的病毒抗原血症.因此,本研究在原核表达系统和实验小鼠水平提供了一种更为简化的HBV cccDNA实验模型系统,并再次显示rcccDNA具有显著的稳定性,能作为一种基本策略在小鼠模型中诱导病毒持续感染.
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整合子系统与细菌多重耐药关系的研究进展
随着抗生索的广泛使用,细菌在抗生素的选择压力下耐药株不断产生,其中细菌通过基因的水平转移,获得外源性耐药基因是加快临床耐药菌株产生的重要原因.与细菌耐药基因水平转移密切相关的遗传结构有质粒、转座子、整合型噬菌体以及近年来在细菌中发现的一种天然的克隆表达系统整合子(integron)[1].整合子通过位点特异性重组捕获外源基因盒(gene cassettes)并使之表达,同时整合子可位于质粒上.