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基于滚环扩增的鸭乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA检测方法的建立
滚环扩增(RCA)是新近发展起来的一种能特异性扩增环形DNA的实验技术,自2008年以来被广泛用于HBV基因全长扩增及共价闭合环状DNA (cccDNA)耐药突变分析等研究.为了便于鸭乙型肝炎病毒(DHBV)cccDNA的分析,本研究建立了基于RCA的DHBV cccDNA的检测方法.通过针对DHBV高度保守序列设计的4对RCA硫化修饰引物,以血清DHBV DNA为阴性对照,从肝组织DHBV DNA标本中扩增得到DHBV cccDNA.然后用跨缺口引物扩增RCA产物测序替代限制性内切酶切分析进行DHBV cccDNA鉴定.应用该方法检测39份携带DHBV麻鸭肝组织与血清标本结果显示:全部肝组织标本均检出DHBV cccDNA,而全部血清标本则均无DHBV cccDNA检出,表明本研究建立的基于RCA的DHBV cccDNA检测法具有良好的特异性和灵敏性.该方法的建立为应用鸭乙型肝炎病毒动物模型研究cccDNA在病毒致病机制中的作用以及评价抗病毒疗效奠定了实验基础.
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HBV相关肝细胞癌肝组织中HBV cccDNA突变位点筛选分析
目的 阐明乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)相关肝细胞癌的癌组织与癌旁组织中HBV cccDNA全基因组的点突变模式及其与HBV cccDNA和总DNA含量的关系,寻找可以作为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者预后判断指标的突变位点. 方法 取23例HCC患者术后肝癌与癌旁组织各1份,采用Qiagen法提取DNA,采用滚环扩增HBV cccDNA,采用Taqman探针法定量测定HBV cccDNA和总DNA.采用PCR分段扩增HBV cccDNA全基因组,PCR产物纯化后测序,确定其基因型,并与标准野生株序列比对,确定HBV cccDNA的突变位点. 结果 肝癌与癌旁组织中HBV cccDNA突变频率较高的位点集中于X和C区,肝癌与癌旁组织突变个数之和大于10的位点有26个.G1719突变组HBV cccDNA和总DNA的含量均低于T1719野生型组(t=2.449,P＜0.05和t=2.525,P＜0.05),G1719突变组患者术后生存时间短于T1719野生型组(x2=8.56,P＜0.05),并且T1719G突变与患者BCLC分级相关,G1719突变组更倾向于较高的BCLC分级(x2=6.296,P＜0.05). 结论 T1719G突变可能成为HCC患者术后预后的早期预测因素,值得进一步研究.
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应用 CRISPR／Cas9系统靶向切割细胞内乙型肝炎病毒基因组的研究
目的：应用近年发展的基因编辑技术成簇规律间隔短回文重复序列（ clustered regularly interspaced short palindromic repeat， CRISPR）引导的Cas9核酸酶特异性靶向切割HBV DNA基因。方法基于慢病毒载体的lentiCRISPRv2系统，我们设计了3个特异靶向HBV基因组的向导RNA序列（ guide RNA， gRNA）。质粒pUC18－HBV1.2和lentiCRISPR-gRNAs共转染HepG2细胞，或lentiCRISPR-gRNAs与相关慢病毒载体转染293T细胞后产生相应慢病毒。用慢病毒处理整合了HBV DNA的HepG2.2.15细胞或者HepDE19细胞系；并用慢病毒处理基于C57BL／6小鼠腺相关病毒HBV复制模型。结果单靶向CRISPR／Cas9切割可以抑制30％～50％病毒蛋白产生。两个或三个靶向切割则显著提高抑制效率，可达70％～90％。以慢病毒体系处理HepG2.2.15或HepDES19细胞时， HepDES19细胞中HBeAg下降幅度约为HepG2.2.15细胞中的3倍。 HBV复制小鼠模型在CRISPR／Cas9慢病毒处理后，血清中HBsAg和HBeAg可转为阴性。结论 CRISPR／Cas9系统多位点靶向切割可高效清除细胞内基因组，相对于整合于染色体的基因组，游离于细胞核的HBV基因组对此靶向切割系统更加敏感。
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乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA检测技术的研究进展
乙型肝炎病毒(HBV)属嗜肝DNA病毒科,它是通过逆转录复制,其复制周期中的关键步骤是双链松弛环状DNA(rcDNA)进入肝细胞核形成共价闭合环状DNA(cccDNA),后者作为病毒mRNA和前基因组RNA(pgRNA)的合成模板,终产生新的病毒颗粒.目前,大多数抗病毒药物并不能有效地清除HBV cccDNA,它是病毒持续感染、抗病毒药物治疗终止后病毒再活化、药物抗性出现的关键原因.此外,HBV cccDNA的检测是HBV感染及抗病毒药物治疗有效的指标.因此,本文主要对HBV cccDNA检测及其研究进展做一综述.
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乙型肝炎病毒cccDNA与HBx蛋白在肝细胞性肝癌中表达的关系及意义
目的:探讨肝细胞性肝癌中乙型肝炎病毒(HBV)occDNA与HBx蛋白表达的关系及其意义.方法:取42例肝细胞性肝癌患者的癌和癌旁组织,采用SABC法检测组织中的HBx蛋白;采用RT-PCR法检测组织中的HBV CCCDNA水平.结果:HBx蛋白在癌及癌旁组织中的阳性例数分别为31例(73.8%)和35例(83.3%),无显著性差异;癌旁组织中cccDNA水平较癌组织中的高,但是统计学检验无显著性差异;癌组织和癌旁组织中HBx蛋白(+)者的cccDNA水平均明显高于HBx蛋白(-)者(P＜0.05).HBx蛋白表达与cccDNA水平呈正相关(r=0.778,P＜0.01).结论:HBx蛋白的表达与cccDNA水平明显相关,他们相互作用、相互影响并在肝癌的发生发展中起重要作用.
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改良聚合酶链反应检测HBV共价闭合环状DNA
目的:建立一种基于聚合酶链反应(PCR)的简便快速、具有较高敏感性和特异性的检测乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)的方法.方法:分别提取HepG2.2.15细胞内的cccDNA及培养上清中的松驰环DNA(rcDNA)样品,试剂盒纯化;设计2对特异性引物,其扩增区域跨越rcDNA单链区;设计2对非特异性引物,扩增区域位于rcDNA双链区.经单链特异性绿豆芽核酸酶(MBN)分别消化cccDNA及rcDNA样品;以特异性引物和非特异性引物对消化前后的两种样品分别进行PCR扩增,并改变PCR扩增参数如底物数量、循环次数等,观察特异性引物能否顺利扩增消化后的cccDNA,同时又不扩增消化后的rcDNA.HBV基因组质粒样品作为对照.此外还采用实际乙型肝炎患者体内病毒样本检验此策略的实用性.结果:分别以非特异性引物和特异性引物扩增不同模板数的HBV rcDNA样品,2对非特异性引物可扩增出模板数在102以上的HBV rcDNA样品,2对cccDNA特异性引物也可以扩增出模板数在104以上的样品.特异性引物在PCR反应模板数较多时将不能区分消化前的rcDNA和cccDNA.不同数量HBV cccDNA和rcDNA模板在MBN消化前后,分别应用非特异性引物和特异性引物进行PCR扩增,发现不同数量的cccDNA模板分子经过MBN消化后,仍可用特异性引物和非特异性引物扩增出相应条带;rcDNA样品经过MBN消化后,非特异性引物可扩增出产物条带,而特异性引物无法扩增出条带.采用此种策略,我们发现慢性乙肝患者血清HBV核酸样品主要成份为rcDNA,并带有少量cccDNA,而肝细胞内HBV核酸样品富含cccDNA,与实际情况一致.结论:联合应用MBN选择性消化和cccDNA特异性引物的PCR检测法简便快速,敏感性和特异性均较满意.
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慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞中HBV cccDNA预测拉米夫定的治疗效果
目的:探讨慢性乙型肝炎拉米夫定治疗结束时,外周血单个核细胞(PBMC)中HBV cccDNA(乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA)检测对拉米夫定持续应答的预测作用.方法:对慢性乙型肝炎患者17例进行拉米夫定治疗48 wk,获得完全或部分疗效(血清HBV DNA转阴,ALT复常,伴或不伴HBeAg血清转换),48 wk治疗结束时检测PBMC中HBV cccDNA,并对患者进行1 a的血清HBVDNA监测.结果:治疗结束时PBMC中HBV cccDNA为阳性9例,阴性8例.在PBMC中HBV cccDNA阳性者,停止治疗的1 a内所有患者的血清HBVDNA阳转.而PBMC中HBV cccDNA阴性者,1例血清HBVDNA阳转.结论:拉米夫定治疗结束时PBMC中HBV cccDNA的检测可能对拉米夫定治疗能否获得持续应答具有预测价值.
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慢性乙型肝炎抗病毒免疫治疗的新策略
目前治疗慢性乙型肝炎的主要方法为核苷(酸)类似物和干扰素α(interferon-α,IFN-α),虽已获得良好的临床疗效,却仍不能完全治愈慢性乙型肝炎,主要原因在于:(1)机体的免疫系统发生免疫失能或者免疫耐受;(2)被感染肝细胞内稳定存在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA).因此研制出可彻底清除机体内cccDNA的药物,以及通过免疫治疗策略的研究,突破机体免疫耐受,重新激活免疫系统,对于控制HBV感染都具有非常重要的意义.本文将就目前为热点的免疫治疗策略:包括淋巴毒素β受体(lymphotoxin β receptor,LTβR)激动剂、治疗性疫苗、Toll样受体(Tolllike receptors,TLR)激动剂、程序性死亡受体l(programmed death 1,PD-1)阻断剂、重定向T细胞以及白介素(interleukin,IL)-12等免疫治疗方法作一综述.
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乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA在慢性乙型肝炎治疗中的分子生物学研究进展
在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染过程中,共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)是病毒复制产生的所有RNA和新病毒颗粒合成的模板,而当前的治疗方法很难彻底清除cccDNA.在cccDNA的产生过程中,由病毒前基因组RNA反转录合成松弛环状(relaxed circular,rc)DNA的细节目前已经比较明确,而对rcDNA转变为cccDNA的过程人们还知之甚少.近的研究把cccDNA的形成和细胞DNA修复联系起来,并表明此过程是病毒与细胞相互作用的关键环节.本文将综述cccDNA的分子生物学研究进展,分析当前研究中遇到的障碍,并讨论把cccDNA作为治疗慢性乙型肝炎的靶点的前景.
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乙型肝炎的“治愈”之路
乙型肝炎流行范围广,是肝硬化、肝衰竭和肝癌的重要病因,严重威胁人类健康.因乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)特殊的复制过程中共价闭合环状DNA(covalent closed circular DNA,cccDNA)的稳态调节和病毒特异性的免疫耐受,造成HBV慢性持续性感染,难以清除.现有的治疗大多只能抑制病毒复制,不能清除乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)和HBV cccDNA.乙型肝炎的“治愈”治疗是科学家一直努力的方向,其标志是HBsAg的消失和肝细胞内HBV cccDNA的清除.近年来,随着对HBV致病机制的深入研究和基因编辑技术的发展,乙型肝炎的“治愈”治疗已曙光初现.本文就乙型肝炎的“治愈”研究方面的进展进行简要综述.
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HBV感染者胎盘组织HBV ccc DNA检测
目的 建立HBV ccc DNA在胎盘组织中定性及定位检测方法,了解慢性HBV 感染者胎盘组织中HBV ccc DNA的存在状况,进一步探讨其意义及乙型肝炎病毒母婴传播机制.方法 选取首都医科大学北京地坛医院慢性乙型肝炎病毒感染者孕晚期胎盘组织40 例,阳性对照肝组织标本3 例,阴性对照为健康足月妊娠产妇胎盘标本,共5例.所有胎盘标本均分两份,分别于-80 ℃冷冻和福尔马林室温浸泡保存.冷冻标本采用质粒抽提法提取胎盘组织中HBV ccc DNA ,液相PCR 定性检测;福尔马林处理标本作石蜡切片,用于原位PCR 定位检测.结果 40例标本中,液相PCR 检测出HBV ccc DNA 阳性者8例,其相应的血清HBV DNA 均 >105 拷贝/ml .取该8例及另2例乙型肝炎患者孕晚期胎盘石蜡切片经HBV ccc DNA 原位扩增,7 例检测出HBV ccc DNA 阳性,胎盘绒毛毛细血管内皮细胞、绒毛合体滋养层细胞、PBMC 等多种细胞均存在HBV ccc DNA 阳性信号.结论 研究表明,胎盘组织HBV 感染与孕妇血液中HBV DNA 含量显著相关.胎盘组织的HBV ccc DNA 原位PCR 检测显示,HBV 可感染胎盘各层细胞.羊膜上皮细胞中也发现HBV ccc DNA 阳性信号.胎盘组织感染的HBV 及其在这些细胞中的复制是否直接与HBV宫内感染相关尚需进一步研究.
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针对共价闭合环状DNA的抗HBV治疗进展
慢性乙型肝炎HBV cccDNA在肝细胞内的持续存在是阻碍慢性乙型肝炎治愈的关键之一.现有抗HBV治疗尚不能作用于HBV cccDNA.随着对于HBV cccDNA生成以及功能基础研究的不断深入,研究者开始从不同角度设计针对cccDNA的治疗策略:干扰素-α以及淋巴毒素β-受体激动剂通过APOBEC3特异性降解cccDNA,通过RNA干扰来抑制rcDNA进入细胞核,通过DNA剪切酶CRISPR-Cas9等靶向降解cccDNA,通过作用于cccDNA表观遗传学修饰以及通过作用于肝细胞代谢等影响cccDNA功能.这些细胞和动物研究结果提示可降低cccDNA水平或抑制cccDNA的功能,给HBV彻底清除带来了希望.
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慢性乙型肝炎患者肝组织 HBV cccDNA含量与血清 HBV 标志物和病毒载量的相关性
乙型肝炎病毒共价闭合环状 DNA （ HBV cccDNA）是嗜肝病毒持续感染和HBV复制的突出标志，也是评价HBV感染状态及治疗效果客观、敏感的指标［1］。监测肝脏内 HBV cccDNA的含量对于病情判断、疗效和预后评估均具有重要意义。本研究通过检测拉米夫定初治后患者肝组织内HBV cccDNA 的含量及血清 HBsAg、HBeAg、HBV DNA等水平，探讨肝组织内HBV cccDNA的含量与HBV血清学标志物和病毒载量的相关性。
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肝细胞癌患者石蜡包埋肝组织HBV ccc DNA的检测
目的 检测肝细胞癌患者肝组织中乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(HBV ccc DNA),探讨其在肝细胞癌发生、发展中的意义.方法 选取20例肝细胞癌患者的癌及癌旁组织,经10%福尔马林固定、石蜡包埋、连续切片,采用0.05%多聚赖氨酸进行处理.经不降解质粒的ATP依赖的DNA酶(PSAD酶)消化后,应用原位滚环扩增(in situ RCA)结合原位跨缺口PCR扩增技术检测肝组织中ccc DNA的表达.结果 20例肝癌患者标本中有17例检测到HBV ccc DNA阳性信号,为蓝色或紫蓝色并呈团块状,定位于细胞核.肝癌患者癌及癌旁组织HBV ccc DNA阳性率分别为10%(2/20)和85%(17/20),差异具有显著统计学意义(P ＜ 0.01).结论 肝细胞癌患者癌旁组织病毒复制水平高于癌组织.
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阿德福韦酯对慢性乙型肝炎患者血清ccc DNA的影响
0.665 log10(与对照组相比两者P＜0.05).结论 阿德福韦酯对血清HBV ccc DNA有明显抑制作用;血清HBV ccc DNA可作为阿德福韦酯抗病毒治疗的重要监测指标.
关键词： 慢性乙型肝炎 实时荧光定量聚合酶链反应 共价闭合环状DNA -
乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的检测与临床应用
目的 建立检测乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)聚合酶链反应法,研究其临床应用价值.方法 根据HBV-cccDNA核苷酸序列特点设计PCR引物,应用PCR的方法检测急性和慢性乙型病毒性肝炎、肝硬化、拉米夫定治疗等病患者的血清、外周血细胞及肝组织cccDNA.结果 急性及慢性乙型病毒性肝炎、拉米夫定治疗等病患者血清的HBV cccDNA检出阳性率分别为15.6％、50.0％、21.2％；前两者外周血细胞检出阳性率分别为10.7％、19.6％；慢性乙型病毒性肝炎(含肝硬化)、拉米夫定治疗等病患者肝组织的HBV-cccDNA检出阳性率分别为91.1％、32.8％.结论 该方法操作简单、特异性强,可用于HBV-ccc DNA的检测,评价抗乙型肝炎病毒药物的疗效.
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儿童乙型肝炎血清乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA与临床和病理分级分期的关系
目的 了解慢性乙型肝炎患儿血清乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(hepatitis B virus covalently closed circle DNA,HBV cccDNA)与病情、肝功能指标及肝组织病理变化的关系.方法 选择HBV-DNA阳性124例乙型肝炎患儿,其中携带者65例,慢性乙型肝炎59例(轻度31例、中度18例、重度10例),检测其血清HBV cccDNA及肝功能,对其中的46例患儿进行了肝脏穿刺,对肝组织进行炎症分级及纤维化分级.结果 中、重度慢性乙型肝炎患儿血清HBV cccDNA阳性率(77.8％、100％)高于携带者和轻度组(32.3％、54.8％)(x2=25.429,P＜0.01),患儿病情越重外周血HBV cccDNA检出率越高.血清HBV cccDNA阳性组的谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆红素[(95.6±18.2) U/L、(88.8±20.3)U/L、(68.4±24.6)μmol/L]均高于阴性组[(52.5±17.7) U/L、(48.4±21.4) U/L、(28.3±23.9) μmol/L](t=15.572、10.750、17.067,P均＜0.01).血清cccDNA与肝组织炎症活动度和纤维化程度无明显相关性.结论 血清HBV cccDNA是代表病毒复制的一个敏感指标,病情越重,外周血HBVcccDNA检出率越高,但其与肝组织炎症及纤维化并非完全一致,所以其不能完全反映肝脏的损伤程度.
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阿德福韦酯持续干预对HepG2.2.15细胞经典耐药突变的诱导作用
目的 观察HepG2.2.15细胞在不同浓度阿德福韦酯(ADV)持续诱导下发生经典耐药突变的情况,并探讨其产生耐药的机制.方法 用不含或含0.01、0.1、1.0μmol/L ADV的培养基于12孔板中培养HepG2.2.15细胞,每3d传代,共培养至110代,分别抽提细胞和上清中的HBV DNA,每10代取样1次.以不降解质粒的ATP依赖性DNA酶消化+滚环扩增+跨缺口PCR方法和单管巢式PCR方法分别扩增细胞内HBV cccDNA和上清中HBV DNA的反转录酶(RT)区.以PCR产物直接测序结合克隆测序法(20个克隆/样本)分析细胞内HBV cccDNA和上清HBV DNA的RT区是否产生经典ADV耐药突变.结果 未经药物处理的对照组持续稳定表达HBV DNA.0.01 μmol/L ADV组和0.1 μmol/L ADV组随着ADV干预时间的延长,细胞内总HBV DNA、cccDNA及上清中HBV DNA的载量持续下降.0.01 μmol/L ADV组细胞内和上清中至110代仍未检测出耐药变异,0.1μmol/L ADV组细胞内和上清中在110代时检测到RT区发生rtA181V+N236T变异.1.0 μmol/L ADV组由于细胞生长受到抑制于第15代时停止培养.结论 HepG2.2.15细胞内存在HBV cccDNA循环池,用含适量浓度ADV的培养基持续培养可以诱导HepG2.2.15细胞发生经典耐药突变.
关键词： 阿德福韦酯 HepG2.2.15细胞 共价闭合环状DNA 耐药变异 -
滚环扩增在乙型肝炎病毒cccDNA检测中的应用
目的 建立慢性乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)的滚环扩增(RCA)方法 .方法 以27例慢性乙型肝炎患者的肝组织cccDNA和血清松弛环状DNA(rcDNA)为研究对象.根据中国患者HBV基因序列特点设计4对引物,分别可与HBV cccDNA的正、负链结合.在Phi29 DNA聚合酶的作用下,获得线性多拷贝cccDNA扩增产物,以该产物为模板获得cccDNA全序列;通过对模板的系列稀释鉴定RCA方法 的灵敏度;以RCA产物为模板扩增肝组织cccDNA的反转录酶区基因,并与同时扩增的同时间采集的同一患者血清中的rcDNA序列进行比较.结果 成功建立了HBV cccDNA全序列的RCA方法 ,低可检测到10个拷贝的cccDNA分子,并获得了所有扩增cccDNA的全基因序列.27例患者中,18例患者的肝组织CCCDNA和血清rcDNA反转录酶区的序列完全一致,9例患者中共检出 84个不同的核苷酸位点,平均每个患者9.3个,84个不同核苷酸中只有5个引起了氨基酸的改变.结论 滚环扩增方法 对肝组织HBV cccDNA的检测具有较好的灵敏度.该方法 的建立对深入了解cccDNA在HBV致病机制中的作用以及评价抗病毒疗效有重要意义.
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乙型肝炎病毒cccDNA临床研究进展
乙型肝炎病毒(HBV)特殊的复制中间体共价闭合环状DNA(cccDNA)是前基因组RNA的转录模板,在病毒持续感染、抗病毒治疗后病毒再度活跃及药物耐受方面起关键作用.有两种免疫机制介导cccDNA的清除,深入研究细胞内cccDNA含量的动态变化,与HBVDNA载量、外周血HBsAg、HBeAg及生化指标的关系,以及免疫学、病毒学的影响因素,在预测肝炎再发、评价抗病毒治疗的效果、预测持续应答率及判断停药时机等方面具有重要作用.
