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基因克隆技术及其进展
基因克隆技术,又称重组 DNA技术,是将目的基因与具有自主复制能力的载体 DNA进行体外重组,获得新的重组 DNA后导入受体细胞中表达相应蛋白,以研究蛋白结构与功能及其与其他分子的相互作用。近,随着非编码 RNA的发现,这项技术也用于 RNA的研究。基因克隆技术从发明到现在经历了三个发展阶段。第一个阶段是20世纪70年代初经典的基因克隆技术的创建[1-2]。经典的基因克隆技术是需要限制性内切酶和连接酶的克隆方法,至今仍被广泛应用。第二个阶段是20世纪90年代初不依赖连接酶的克隆方法的出现[3]。这种方法不需要连接酶的参与,不受限制性内切酶的限制,使得基因克隆更加灵活。第三个阶段是21世纪初将重组酶运用到基因克隆中[4],使基因克隆更加强大,靶向性更强,操作更简便。本综述从基因克隆技术发展的这三个阶段入手,概述各项方法的原理和特点,方便人们根据自己的需求选择合适的基因克隆方法。
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Daudi细胞系特异性Fab噬菌体抗体库的构建、筛选及鉴定
本研究以人B细胞淋巴瘤Daudi细胞免疫的小鼠脾淋巴细胞RNA出发,用基因克隆技术将B细胞全套κ轻链和重链Fd片段基因克隆出来,组装到表达载体pComb3H-SS内并表达到噬菌体表面,构建出Daudi细胞系特异性Fab噬菌体抗体库.以Daudi细胞为抗原对抗体库筛选后,获得针对B细胞淋巴瘤Daudi细胞系膜抗原的抗体.
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肿瘤特异性抗原-MAGE家族的研究进展
1991年van der Bruggen等[1]用基因克隆技术首次发现了恶性黑色素瘤细胞表达一种MAGE-1(melanoma antigen-1)基因,其编码抗原MZ2-E在黑色素瘤和其它多种肿瘤中均有不同程度的表达,而在正常组织中除睾丸和胎盘外均不表达.进一步研究发现和MAGE-1高度同源的还有另外11种基因,而且这些基因编码抗原和MAGE-1抗原一样,也是特异性地在肿瘤中表达,因此人们将这12种基因共同命名为MAGE基因家族.MAGE-1基因全长4.5 kb,由3个外显子(exon)组成,和MAGE家族的其它成员一样,氨基酸编码序列全部位于第三外显子,MAGE家族的基因全部位于人类性染色体X长臂的Xq28上[1,2].目前已证实,MAGE基因在多种不同的肿瘤中都有表达,如食管癌、胃癌、肠癌、肺癌、肝癌、头颈部癌、黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌、肾细胞癌、膀胱癌、骨肉瘤、神经系统肿瘤等[3-23].
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特尔津与莱格司亭在儿童血液与肿瘤疾病治疗中疗效对比
粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factot,G-CSF)是一种多肤链的造血生长因子,由单核细胞、成纤维细胞和内皮细胞产生,能与细胞表面的特定受体结合,调节粒细胞的增殖与分化,促使中性粒细胞系造血祖细胞生长和分化,保护中性粒细胞避免凋亡并加强它们的功能.随着基因克隆技术的发展,人工合成粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)已被广泛地用于由各种原因引起的粒细胞减少症并取得了较好的疗效.
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MicroRNA在红细胞生成及血液系统疾病中的作用
MicroRNA (miRNA)是一种内源性长约19 ~ 24个碱基的非编码单链小分子RNA,在动植物体内广泛存在,作为控制幼虫发育的时序基因首先在线虫体内被发现[1].随着生物信息学和基因克隆技术的迅速发展,现已在人类发现541个miRNA,记录于miRNA数据库(http://microrna.sanger.ac.uk)[2],约1/3的人类蛋白质编码基因受到miRNA的调控[3].
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以"基因克隆的教学"为例探讨实验课新教师面临的挑战
新人教师是影响教育教学质量的重要群体,一个好的开端将对后来的教学工作有着积极的影响.实验技术教师已经成为各高校专业教学资源中不可或缺的部分,由于自身工作的特点,导致实验技术新教师在教学初期将面临更多的挑战和问题.以"基因克隆技术的实验教学"为例探讨、发现这些问题,其目的 是帮助实验技术新教师发现并克服问题,这关系着学校的教育质量和学生将来的发展,以及自身在今后教学生涯中的成长和发展情况.
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基因芯片技术在子宫内膜异位症中的研究进展
基因芯片是伴随着人类基因组计划实施而发展起来的前沿生物技术,是继基因克隆技术、基因测序技术、PCR技术后的又一次革命性的技术突破.基因芯片通过对个体不同发育阶段或不同生理状态下大量基因表达的平行分析,研究相应基因在生物体内的功能,阐明不同层次多基因协同作用的机制,进而在人类重大疾病如癌症、心血管疾病等的发病机制、诊断治疗、药物开发等方面的开发研究发挥巨大的作用.本文就基因芯片技术在子宫内膜异位症(EM)中的研究进展作一综述.
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丙型肝炎病毒基因和蛋白结构研究进展
估计全球约有1.7亿人口感染丙型肝炎,是一种严重影响人类健康的传染病.丙型肝炎的病原为丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV).1989年Choo等人首先获得HCV基因组的cDNA全序列,使HCV成为病毒学史上第一个首先通过基因克隆技术确认的病毒[1,2].此后,HCV的分子生物学研究进展迅速.现将HCV病毒分子结构的新研究状况做一综述.
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人类生长素的代表产品--美国休普生命口服液
美国休普抗衰老液--人类生长素(human growth hormone,HGH),是近年来美国采用基因克隆技术研制出的,而且在市场上具代表性的保健食品,在美国市场连年达到了卖点高、市场销量大的指数,并获得FDA、GMP双重认证,目前这种产品在美国已经成为不用广告、不用宣传、众多消费者自愿理性选择的日用保健消费品.
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生物医学发展前沿对管理创新的影响重庆市科委软科学课题
当前,由于生物医学的发展异常迅猛,不断出现新的研究领域和新的发展方向,有的正处于重大突破的边缘,因此,关注和研究当前生物医学发展前沿,了解其变化和走向,对推动生物医学发展,加强科研管理的战略性导向,促进管理创新,具有十分重要的意义。1 当前生物医学发展的几个重要前沿领域 1900年,De Vries Correns和Von Tschermak不约而同地重新发现了Mendel的遗传定律并证实了它的重要性。接着Morgan创立了染色体基因学说,并获1933年诺贝尔生理学与医学奖。在这些重大科学发现的推动下,当时的遗传学、细胞学、实验胚胎学等得到了蓬勃的发展。20世纪中叶,随着自然科学,特别是化学的原理和实验方法不断向生物医学领域渗透,生物化学、生物物理学、生理学和病理学都取得了长足的进步。1953年Watson和Crick提出的具有里程碑性质的DNA双螺旋结构模型,奠定了分子生物学基础。从此人类着重从生物大分子的结构与功能的角度来探究生命的奥秘和疾病发生机理。20世纪70年代,出现了以基因工程为核心的生物技术,并形成了人类又一个新兴产业——生物技术产业,极大地推动了医学、农业及相关工业向生物高技术产业方向发展。同时由于基因克隆技术的诞生,标志着人类已开始掌握操纵遗传物质和信息的基本手段。近20多年来,与生物化学、生物物理学融为一体的分子生物学发展尤为迅速,特别是进入90年代,美国“人类基因组计划”(HGP)的正式实施,把生物医学全面推进到了基因水平,并形成了一门崭新的学科——基因组学。从此,人类将从基因水平上来探讨疾病发生、发展和转归的规律,并从根本上采取诊治和预防措施。可以说,在当代生物医学研究中,只要涉及重要生命现象与重大疾病的课题,几乎都离不开分子生物学和基因组学。这是当代生物医学分析层次的反映,也是当前生物医学的基本特征。。
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现代两大诺贝尔获奖技术相结合的启示——单细胞RT-PCR技术建立的哲学思考
现代医学技术中,Patch clamp和基因克隆技术,尤其是PCR技术被认为是当代给生命科学研究带来巨大前进动力的两大科学技术。两项技术的发明者分别于 1991年获生理学和诺贝尔奖医学[1], 1993诺贝尔化学奖[2]。两项技术在不同领域的获奖,即表明了这二项技术成果的学术价值和它对世界的影响。而在这二项技术的基础上,有机地将这二大技术相结合而建立的单细胞RT-PCR技术,则更能看出高新技术的产生和发展对科学进步和社会发展的作用。1 技术目的与技术手段的对立统一是单细胞RT-PCR技术产生的直接动力 1976年由Neher和Sakmann共同创立的Patch clamp技术是生理学界和神经科学界的一次技术革命,在电生理方面它的出现实现了由整体到局部再到细胞的生理记录,为科学工作者提供了了解单一通道变化特点的手段。Patch-clamp技术的产生,扩大了生理的应用范围,适用于以往难以研究的哺乳类动物的小细胞或脆性很大的细胞。另外还可监测微小的与细胞分泌有关的膜电位的变化。因此它被认为是与基因克隆技术并驾齐驱的,给生命科学研究带来巨大的前进动力的科学技术,Neher与Sakmann因此获得1991年度诺贝尔生理学和医学奖[1]。PCR技术是分子生物学技术的里程碑,被列为90年代生物技术10大热点之首。它的产生为研究生物遗传物质提供了高效简单、特异的方法。对各国的经济发展,社会稳定及解决全球性五大“危机”——能源、资源、粮食、人口和环境作出了重大贡献[2]。
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利用生物信息学资源进行差异表达ESTs的分析与新基因的克隆
人类真核细胞中大约有70,000个不同的基因,不同类型的细胞所表达的基因不同,即便是同一类型的细胞,在特定时刻同时表达的基因也是很少的一部分,约占基因总数的10~15%.基因差异表达决定了生命的所有过程,分析不同类型的细胞以及同一细胞在不同病理和生理状况下的基因表达差异可以有助于我们获得与生命本质有关的信息,揭示疾病发生发展的分子机制.因此,如消减杂交与基因芯片等差异表达(Differential display)基因的克隆技术越来越多的应用于生命科学研究领域.随着生物技术的发展,各种差异表达基因克隆技术日益成熟,每种方法的应用都会使我们获得少则几十条多则上百条的差异表达的ESTs(expressed sequence taps,ESTs),如何对这些ESTs进行分析以获得有价值的信息并拟定新基因的克隆方案具有重要意义.
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黑色素瘤基因-3的研究进展
黑色素瘤抗原(melannoma antigen-encoding,MAGE)基因是从黑色素瘤中分离,鉴定出来的一族肿瘤抗原基因,自1991年Van der Bruggen等[1]用基因克隆技术首次发现了MAGE-A1抗原以来,对MAGE家族的研究及认识都在不断的深入,更为肿瘤治疗性疫苗的发展奠定了基础,MAGE抗原与MHC类分子特异性结合成复合物,被自体细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别,诱发CTL增殖,增强其杀伤相应肿瘤细胞的活性,可使部分病人的肿瘤有所缩小或完全消退[2].迄今已发现MAGE家族包括A、B、C、D、E等13个亚家族,该家族至少有83个密切相关的基因成员[3].其中,黑色素瘤抗原基因-3(MAGE-A3)为MAGE家族中A亚家族成员的一员,以其独特的表达特征及在肿瘤生物学方面的特殊意义,被认为是肿瘤特异性免疫治疗的理想靶分子.
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生物芯片将给医学带来什么
21世纪是生命科学的世纪,人类基因组计划即将完成,蛋白质组计划已经启动,基因序列数据及蛋白序列数据正在以前所未有的速度增长.然而,怎样去研究如此众多基因及蛋白质在生命过程中所担负的功能就成了全世界生命科学工作者共同的课题,生物芯片正是在这样的背景下应运而生.生物芯片不仅在高通量基因测序、基因表达研究中发挥了重要作用,也将在后基因组时代研究蛋白质及蛋白质间的相互作用方面发挥极其重要的作用,也将在临床基因诊断中占据重要地位.生物芯片技术是生命科学研究中继基因克隆技术、基因自动测序技术、PCR技术后的又一次革命性技术突破.科学界认为,生物芯片技术将给生命科学和医学研究带来一场革命.
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环氧合酶-2与大肠癌发生发展的研究现状
1环氧合酶的基本概念环氧合酶是前列腺素(PGs)合成过程中重要的限速酶.1976年Myamoto等从牛的精囊腺提纯了PGHS-1,称环氧合酶-1(COX-1),1991年,Xie等又分离到COX-2蛋白酶,并证实它是一种不同于COX-1的诱导性酶,用基因克隆技术发现COX-1基因和COX-2基因具有不同的结构和生理功能.
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重组血吸虫诊断抗原研究进展
免疫学方法为诊断血吸虫病的重要手段,目前,用于血吸虫病免疫诊断的常用的抗原是成虫抗原和虫卵抗原.成虫抗原和虫卵抗原成分复杂,针对两种抗原的血清抗体在宿主体内长期存在,不能区别早期感染和既往感染,不能考核疗效,并且这两种抗原不易大量获得.现代生物技术的发展为解决上述问题提供了机遇.基因克隆技术能够帮助寻找刺激宿主产生短程抗体的某些抗原表位,通过检测短程抗体来评价治疗效果.同时依靠基因重组技术可以生产出相应的重组抗原分子,为现场推广应用所需大量的抗原材料提供了保证.本文主要就国内外研制基因重组抗原及其在血吸虫病诊断中的应用加以综述.
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大环内酯类抗生素的基因工程研究
大环内酯类抗生素的基因工程研究进展十分迅速.不仅对此类抗生素的生物合成途径,参与基因及调控机理有了更透彻的认识,而且还应用基因工程技术有目的地改造其结构并创造出了一些体内外抗菌活性及治疗效果显著改观的新的大环内酯类抗生素.
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血管性血友病因子与血管损伤性疾病
血管性血友病因子(von Willebrand Factor,简称vWF),是血浆中的一种具有粘附功能的糖蛋白,除存在于血浆中外,还出现于血小板、内皮细胞以及内皮下组织中.在血浆中,vWF以多聚体形式存在.多聚体由几乎完全相同的成熟亚基组成.每多聚体中亚基数目可从2个到20余个不等.vWF的分子缺陷或生成不足可导致血管性血友病(vWD).该病先在1926年在芬兰报告.由于基因克隆技术和测序技术的应用,1985年vWFcDNA被克隆并依此推导出其蛋白质一级结构.在此基础上,研究人员开始对vWD的结构与功能的关系等问题进行细致的探究,为基础分子生物学增添了许多新内容.
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临床检验中PCR技术的应用
医学检验大致可分为形态学、生物化学、血清免疫学和分子生物学几大类,其分别代表几代实验诊断技术.60年代DNA双螺旋结构及半保留复制模式的出现,70年代基因重组及体外基因克隆技术、分子杂交技术的应用使分子生物学在疾病诊断中得到了长足的发展.特别是1985年Mullis发明了聚合酶链式反应(PCR)技术,使医学界真正兴起了基因诊断技术热,成为现代医学发展的又一里程碑.用于临床检验的PCR技术与经典的PCR反应在操作上稍有区别,有其自己的特色.一般在样品处理上,多采用非离子去污剂一次加热处理,这种方法对DNA纯化有限,但适应临床微量、快速的特点.另外PCR反应体系中各组成成份往往都预分装到反应管中,既减少操作者的工作强度而且也减少了污染的机会,具有极高的使用价值.
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生物芯片-21世纪的生物技术革命
二十一世纪是生命科学的世纪,人类基因组计划即将完成,蛋白质组计划已经启动,基因序列数据及蛋白质序列数据正在以前所未有的速度迅速增长.然而,怎样去研究如此众多基因及蛋白质在生命过程中所担负的功能就成了全世界生命科学工作者共同的课题.生物芯片正是在这样的背景下应运而生.生物芯片不仅在高通量基因测序、基因表达研究已经发挥了重要作用,也将在后基因组时代研究蛋白质功能及蛋白质间的相互作用方面发挥极其重要的作用;也必将在临床基因诊断中占据重要的地位.生物芯片技术是生命科学研究中继基因克隆技术、基因自动测序技术、PCR技术后的又一次革命性技术突破.