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产高活性糖化酶黑曲霉的筛选工艺研究
以实验室保藏的原始菌株作为诱变的出发菌株,通过紫外线和硫酸二乙酯诱变,获得产酶较高的菌株.经8次传代,酶活较稳定.其中第6代菌株所产糖化酶活为2773U/mL,比原菌株的产酶能力提高17.98%.
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一株产苯乳酸的植物乳杆菌发酵条件的研究
目的:探讨一株产苯乳酸的植物乳杆菌突变株KLDS1.0728-16-30的佳发酵条件.方法:采用平板菌落计数方法,确定适发酵温度、接种量、pH、搅拌速度和发酵时间.结果:该菌株按照1%接种量,在37℃、pH 6.5、100 r/min条件下培养8 h后,发酵液活菌数达到高值,为1.09×1010 CFU/mL.结论:经过优化发酵工艺参数,使活菌数提高了近一个数量级,为该菌株的开发和应用提供了参考.
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乙型肝炎病毒准种特点与抗病毒治疗应答不良研究进展
准种的概念是由Eigen[1]在研究RNA病毒分子复制机制时首先提出的,2005年中国《慢性乙型肝炎防治指南》将乙型肝炎病毒(HBV)感染者体内形成的以一个优势株为主的相关突变株病毒群称为HBV准种[2].HBV准种的动态变化与抗病毒治疗效果有着密切联系,为此研究HBV准种特点能为临床提供抗病毒治疗的选择有着指导意义,亦为研发新的抗病毒药物提出挑战.
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HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者血清HBV前C区的序列分析
为了解HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者中HBV前C区突变株流行情况,本研究对31例HBeAg阴性慢性乙型肝炎住院患者血清HBV前C区序列进行了分析,血清标本采自广西南宁市各大医院,按2000年全国第10次病毒性肝炎和肝病学术会议修订的"病毒性肝炎防治方案"诊断.其中男性25例,女性6例,年龄为18~36岁.
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变形链球菌耐酸性缺陷株的构建
变形链球菌(简称变链菌)是主要的致龋菌,耐酸性是其关键的毒力因子,但对其基因调控机制并未明了.本实验欲用转座子Tn917随机诱变变链菌野生株UA159,筛选耐酸性变异的突变株,以便于找到一个与耐酸性相关的调控基因.
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以lacZ作为报告基因研究霍乱弧菌irgA基因表达的铁调控性
细菌蛋白分泌表达基因水平的调控与许多环境信号密切相关,铁浓度作为环境信号影响许多基因的表达。irgA为霍乱弧菌中铁抑制外膜蛋白,在乳鼠模型中检测irgA突变株毒力下降100倍。鉴于irgA的可诱导表达,其启动子在可调控高效表达外源基因方面可能会发挥较好的作用。本研究用启动子探测质粒、以lacZ作为报告基因对irgA在大肠杆菌工程菌中的铁浓度调控表达方面进行了初步的定量研究。
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LuxS基因缺失的变形链球菌突变株的构建及鉴定
目的 通过同源重组法构建LuxS基因缺失的变形链球菌(Streptococcus mutans)突变株.方法 运用基因同源重组方法将红霉素抗性基因(Eymr)连接到PCR扩增LuxS基因两端区域产生的2个基因片段之间,并共同插入到pUCl9载体的多克隆位点中,构建出带红霉素抗性标志的缺失突变载体pUCluxKO.将突变载体转化到含完整LuxS基因的突变受体变形链球菌标准株中,红霉素筛选出LuxS基因缺失的变形链球菌突变株,并经PCR、生物荧光检测及DNA测序鉴定.结果 构建的突变载体经限制性内切核酸酶酶切分析显示,产生的条带与设计结果完全一致.PCR方法扩增突变株LuxS和Eymr基因显示,LuxS基因已被完整敲除掉,经生物荧光检测,突变株不能诱导哈氏弧菌(Vibrio harveyi)BBl70的生物发光,说明不能产生信号分子AI-2(autoinducer-2).DNA测序证实筛选得到了LuxS基因缺失的变形链球菌突变株.连续传代培养后证实,变形链球菌LuxS基因突变株具有良好的稳定性.结论 成功构建出LuxS基因缺失的变形链球菌突变株,为研究LuxS基因对变形链球菌致龋毒力的影响奠定了基础.
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靶向敲除问号钩端螺旋体鞭毛相关fliN基因及其突变株致病性变化
其引起J774A.1细胞坏死和细胞凋亡率(30.6%和22.7%)也明显低于野生株(48.2%和35.2%)(P<0.05).结论 fliN基因产物与问号钩体黏附细胞、分泌毒力因子和诱导细胞凋亡密切相关.采用基于自杀质粒基因敲除技术可用于研究问号钩体靶基因产物的致病机制.
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赖型钩端螺旋体017株外膜蛋白新基因ompL17基因靶向敲除及其突变株的构建
目的将外膜蛋白新基因ompL17靶向敲除并构建该基因的突变株. 方法提取钩端螺旋体017株基因组DNA,扩增出外膜蛋白新基因ompL17,与打靶载体p2NIL重组,并插入氨苄抗生素抗性基因Ampr+使外膜蛋白新基因ompL17失活,构建重组的基因打靶质粒p2NIL17A.电穿孔转化入钩体017株中构建突变株,通过豚鼠模型观察该突变株的毒力变化. 结果 PCR、Dot blot和酶切分析,证实构建了以氨苄青霉素抗性基因DNA为标记探针的基因打靶载体,并构建外膜蛋白新基因ompL17敲除的钩体017株突变株. 结论成功将钩体外膜蛋白的新基因ompL17进行靶向敲除,并构建钩体017株突变株,为进一步进行该基因的功能研究和阐明赖型钩体致病的分子机制奠定了基础.
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中国幽门螺杆菌cagA基因敲除突变株生物学特性分析
细胞毒素相关基因A蛋白(cytotoxin-associated gene A,CagA)是幽门螺杆菌(Hp)重要的毒力因子之一[1].流行病学研究认为,CagA阳性Hp感染与消化性溃疡和胃癌发生的关系比CagA阴性菌株更为密切,提示CagA可能是一种重要的疾病相关蛋白,在Hp致病过程中发挥作用[2].由于Hp菌株自身的变异,CagA阳性株与CagA阴性株间除cagA基因外存在许多差异之处,因此,在自然状态下很难对cagA基因功能做出真实判断.为此,本室自行构建了Hp中国株cagA基因敲除突变株,在此基础上通过比较遗传背景相同的野生株(cagA+)与突变株(cagA-)的生物学特性差异,探讨cagA基因缺失对Hp生物学特性的影响,可供cagA基因功能的研究参考.
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呼吸道合胞病毒逃逸株对单克隆抗体预防的抵抗
目的探讨体外筛选的呼吸道合胞病毒抗体逃逸株生长特性、F蛋白免疫反应性及在棉鼠体内对抗体免疫预防的抵抗,旨在证实用单克隆抗体免疫预防的负面效应,为今后临床可能出现的抗体逃逸株提供线索. 方法呼吸道合胞病毒(RSV) A2株在逐渐升高的Palivizumab(PZ)浓度环境中连续传代5次并经单噬斑纯化后获得PZ逃逸株MP4.用RT-PCR法扩增A2及MP4全长F基因并自动测序;用微量中和试验鉴定MP4在体外对PZ中和反应的抗性;用Western blot鉴定其F蛋白免疫反应性的变化;后在棉鼠模型内观察PZ预防A2和MP4感染的效果. 结果与A2母株比较,MP4于F基因828位核苷酸发生突变(A→T),导致272位推导氨基酸由赖氨酸变为甲硫氨酸.MP4在体外及在棉鼠肺内的生长能力无明显改变.MP4 F蛋白虽仍可表达于受感染细胞膜上, 但不再被PZ识别.动物实验证实,即使大剂量PZ亦不能预防MP4感染. 结论体外筛选的PZ逃逸株在棉鼠模型体内对同一抗体的免疫预防具有极强的抗性,类似情况是否会在人体内发生及是否会导致严重后果尚有待进一步研究.
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错配PCR技术在快速检测耐药结核分枝杆菌中的应用
耐药结核病的早期快速诊断是结核病控制中亟待解决的关键问题之一.利用基因型检测耐药性包括PCR产物直接测序法,错配PCR法等[1-2].错配PCR技术早由Newton等于1989年建立并用于人抗胰岛素基因缺陷的检查,目前已广泛应用于基因点突变的检测[3-4].根据PCR引物设计的不同,可将其分为间接错配PCR,即引物与野生型完全互补,以突变株为模板不能扩增得到PCR产物,和直接错配PCR,即引物与特定的点突变完全互补,以野生株为模板不能扩增得到PCR产物.已有用间接错配PCR方法检测结核分枝杆菌利福平耐药的报道[5-6].本研究以检测耐利福平的结核分枝杆菌rpoB基因531位点的点突变为对象,建立了直接错配PCR法,并与间接错配PCR法进行了比较.
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寻求缩小乙型肝炎表面抗原检测结果间差异
编辑同志:目前,HBsAg的检测各医院常用的方法有ELISA法、斑点膜法及微粒子化学发光法(如罗氏、雅培全自动免疫分析系统)等,HBsAg检测的仪器、试剂不同,检出的灵敏度差别很大,如ELISA方法,试剂厂家不同检测下限可为1 ng/ml、0.5 ng/ml,还有的可低于0.5 ng/ml,而微粒子化学发光法低可检测0.062 5 ng/ml,斑点膜法为定性方法,由于各医院实验室使用的仪器、试剂不同;方法学灵敏度的差异;检测中的干扰因素;试验人员的操作误差;免疫反应的前后带现象造成的假阳性或假阴性结果以及HBsAg突变株的影响;使得HBsAg检测结果常出现矛盾现象,为此引起的医疗纠纷已屡屡出现.
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幽门螺杆菌中国临床分离株iceA基因突变株的构建和鉴定
目的:构建幽门螺杆菌( H pylori)iceA基因突变株.方法:克隆iceA基因及两侧的部分序列至载体pBluescript SKⅡ(-)多克隆位点中.运用基因重组方法将卡那霉素抗性基因(kam)插人iceA基因片段之间,构建出带卡那霉素抗性标志的突变载体pBS-iceA-kam.再将突变载体转化至H pylori中国临床分离株MEL- H pylori27中,用卡那霉素筛选iceA基因的突变株,经PCR和DNA测序鉴定.结果:用PCR方法扩增突变株基因组DNA,结果显示卡那霉素抗性基因已插入iceA基因片段中,测序进一步证实已筛选获得H pylori中国临床分离株iceA基因的突变株.结论:成功构建一株H pylori iceA基因突变株.
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河南抗-HBe阳性慢性乙型肝炎患者病毒前C区1896位点的突变及临床意义
目的:了解抗-HBe阳性慢性乙型肝炎患者HBV前C区1896位点的突变状况.方法:应用3'碱基特异聚合酶链反应(3'BS-PCR)结合PCR产物直接测序法检测前C区热点突变.结果:72例抗-HBe阳性慢性乙型肝炎患者HBV前C区1896位点突变检出率为34.7%;慢性肝炎重度患者19例检出8例单纯突变株感染,其检出率显著高于慢性肝炎轻度组(P<0.05);慢性肝炎重度组总突变率(47.4%)亦显著高于慢性肝炎轻度组(17.4%)(P<0.05);16例患者经测序发现有1例存在前C 1899位点G→A点突变.结论:河南地区抗-HBe阳性慢性乙型肝炎患者存在一定比例的病毒变异株;HBV前C区1896位点的变异与慢性肝炎进展程度相关.
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结核分枝杆菌katG S315T突变频率及突变株特征的研究
近年来分子遗传学研究表明,异烟肼(INH)耐药机制复杂,涉及多个基因,至少包括katG、inhA、kasA以及ahpC等基因[1-3].研究表明,INH耐药与编码过氧化氢酶-过氧化物酶的katG基因突变的联系强[4,5],其中katG基因的一种特定替换,315位密码子的AGC→ACC(Ser→Thr,或katG S315T)颠换报道多.
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海分枝杆菌iip突变株感染能力降低的分子机制
海分枝杆菌与结核分枝杆菌同属于分枝杆菌属,遗传学性状相似.海分枝杆菌对人体危害小,生长速度相对较快,操作安全方便[1-2],已成为研究结核分枝杆菌致病机制的有效模型[3-5].
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HIV突变也许能给患者带来更多的存活机会
南非的艾滋病研究人员报告,那些感染了一种来自具有HLA基因序列而能够控制病毒的人的HIV突变株的个体,可能具有较大的存活优势,即使他们本身不具有同样的基因序列.
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搭载后红曲霉菌突变株的染色体DNA随机扩增多态性分析研究
目的研究太空诱变机理.方法利用染色体DNA随机扩增多态性分析(RAPD)技术,对经"神舟"3号返回式飞船搭载的高产红曲霉菌进行DNA多态性分析.结果 突变株基因组DNA发生了改变.结论突变株洛伐他汀产量的提高与其遗传基因的变异有关,太空诱变是通过改变搭载菌株的遗传基因而实现的.
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副溶血弧菌calR的基因敲除株与回补株构建
目的 构建副溶血弧菌calR的基因突变株和回补株,为研究CalR的功能奠定基础.方法 PCR扩增calR基因的同源臂融合片段,并直接克隆入自杀质粒pDS132中.通过接合转移的方式将重组自杀质粒转入副溶血弧菌RIMD2210633株(WT)中,利用同源重组的方法替换原始calR基因以构建calR无痕突变株(ΔcalR).PCR扩增calR的基因序列,并将其直接克隆入pBAD33质粒中,构建回补质粒.将回补质粒转入到ΔcalR中,即得回补株(ΔcalR/calR∷pBAD33).将vopN的启动子区克隆入pHRP309质粒的β-半乳糖苷酶基因上游,构建LacZ重组质粒,并将该重组质粒分别转入WT/pBAD33、ΔcalR/pBAD33和ΔcalR/calR∷pBAD33中,通过测定并比较3株菌中β-半乳糖苷酶活性的差异来判定CalR对vopN的调控关系.结果与结论 LacZ结果表明,CalR负调控vopN的转录,且回补株的回补效果良好,表明成功构建了副溶血弧菌calR基因的突变株和回补株,为后续对CalR的功能研究打下了基础.