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错配PCR技术在快速检测耐药结核分枝杆菌中的应用
耐药结核病的早期快速诊断是结核病控制中亟待解决的关键问题之一.利用基因型检测耐药性包括PCR产物直接测序法,错配PCR法等[1-2].错配PCR技术早由Newton等于1989年建立并用于人抗胰岛素基因缺陷的检查,目前已广泛应用于基因点突变的检测[3-4].根据PCR引物设计的不同,可将其分为间接错配PCR,即引物与野生型完全互补,以突变株为模板不能扩增得到PCR产物,和直接错配PCR,即引物与特定的点突变完全互补,以野生株为模板不能扩增得到PCR产物.已有用间接错配PCR方法检测结核分枝杆菌利福平耐药的报道[5-6].本研究以检测耐利福平的结核分枝杆菌rpoB基因531位点的点突变为对象,建立了直接错配PCR法,并与间接错配PCR法进行了比较.
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成人迟发型自身免疫性糖尿病:来自UKPDS的经验
成人迟发型自身免疫性糖尿病(LADA)的主要临床特征是初始病情较轻,自身抗体阳性和终需要胰岛素治疗.根据UKPDS的研究,UKPDS中12%的新诊糖尿病患者GAD65抗体(GADA)和/或胰岛细胞抗原2抗体(IA-2A)阳性并且采用2型糖尿病管理模式进行管理.在本文当中,我们比较了UKPDS中LADA患者和其他研究中LADA患者的资料.结果表明,与其他研究中LADA患者相似,UKPDS中LADA患者确诊后需要开始采用胰岛素治疗的时问早于非LADA糖尿病患者.此外,UKPDS中,被随机分为口服降糖药治疗组和胰岛素治疗组的LADA患者胰岛功能减退的速度相似,这与当前LADA确诊后立即采用胰岛素治疗可以延缓胰岛功能减退速度的假说相悖.与一般观点不同,LADA确诊后GADA或抗原决定表位特异性检测不能用来预测疾病进展.尸检报告表明,LADA患者生前患有缓慢进展的胰岛炎及胰腺β细胞数量减少,这可以解释患者生前一直残存C肽释放功能.UKPDS中的LADA患者和成年及儿童发病的Ⅰ型糖尿病患者具有相似的人白细胞抗原(HLA)基因及胰岛素基因(INS)位点.综合分析提示,LADA是一种成人发病的1型糖尿病,而不是一种独立的病种,也不是1型和2型糖尿病之间的过度状态.
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胰岛素基因在HepG-2细胞系中的调节表达
用脂质体介导法将质粒p(GIRE)3BP-11×Furin转染至HepG-2细胞.培养该细胞,以不同浓度的葡萄糖或胰岛素加入培养基.结果 显示,葡萄糖和胰岛素均能浓度依赖地分别刺激和抑制胰岛素基因的表达.
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小干扰质粒干扰肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源物A对小鼠胰岛β细胞增殖及胰岛素基因表达的影响
目的 探讨肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源物A (MafA)对胰岛β细胞增殖及胰岛素基因表达的影响. 方法 采用RT-PCR和Western blot分别测MafA mRNA 和蛋白的表达,筛选佳小干扰质粒(siRNA),分为转染对照组(Cy3组)、阴性对照组(Scramble组)、阳性对照组(siβ-actin组)及实验组(即siMafA-1、siMafA-2和siMafA-3组).按不同葡萄糖浓度分为5.6 mmol/L、10 mmol/L、25 mmol/L.根据不同葡萄糖浓度是否加入siRNA分为未加siRNA的对照组:A0组5.6 mmol/L、B0组10 mmol/L、C0组25 mmol/L;加入siRNA的实验组:A1组5.6 mmol/L、B1组10 mmol/L、C1组25 mmol/L.测MafA基因沉默后MIN6细胞增殖、胰岛素(Insulin)-1和Insulin-2 mRNA表达、MafA蛋白表达及上清液胰岛素浓度的变化. 结果 siMafA-2组干扰效果好.C1组MafA蛋白表达较C0组下降(P<0.05);MIN6细胞增殖、Insulin-2 mRNA表达和上清液胰岛素浓度均降低(P<0.05).A1组与A0组比较,MafA蛋白表达比较,差异无统计学意义(P>0.05);MIN6细胞增殖、Insulin-2 mRNA表达和上清液胰岛素浓度比较,差异无统计学意义(P>0.05).不同糖浓度各亚组与对照组Insulin-1 mRNA表达比较,差异均无统计学意义(P>0.05). 结论 siRNA-2组是理想的siRNA.MafA下调可抑制小鼠胰岛β细胞增殖.MafA下调可抑制小鼠Insulin2 mRNA表达和胰岛素分泌.
关键词: MIN6细胞 肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源物A 胰岛素基因 -
亚砷酸钠对NIT-1细胞胰岛素合成与分泌的影响
目的 观察亚砷酸钠(NaAsO2)对胰岛β细胞NIT-1胰岛素合成与分泌的影响. 方法 体外培养NIT-1细胞,NaAsO2处理后,以MTT法检测细胞的增殖活性,用ELISA测定胰岛素分泌情况,RT-PCR法检测胰岛素mRNA的表达. 结果 (1)当NaAsO2浓度大于4μmol/L时抑制细胞增殖,细胞增殖抑制率随NaAsO2浓度的增加及作用时间的延长而增加.(2)作用24 h,8μmol/L组不同浓度葡萄糖刺激的胰岛素分泌和胰岛素mRNA表达均明显减少(P<0.05);作用48 h,4μmol/L组和8μmol/L组不同浓度葡萄糖刺激的胰岛素分泌和胰岛素mRNA表达均明显减少(P<0.05),而且8μmol/L组对高糖(16.5 mmol/L)刺激的胰岛素分泌与基础(5.5 mmol/L)胰岛素分泌差异无统计学意义. 结论 砷(As)对NIT-1细胞胰岛素分泌和胰岛素基因表达的影响与作用时间和剂量有关,胰岛素合成与分泌障碍可能是(As)影响胰岛β细胞功能进而引发糖尿病的机制之一.
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继往开来加强对糖尿病及其并发症防治的临床研究
糖尿病(DM)作为一种古老的疾病医史记载已逾千年,随着人类社会文明发展,其患病率明显增加,20世纪末糖尿病与心脑血管病及肿瘤已成为威胁人类健康的主要慢性疾病而受到世人的关注。与此同时,对DM复杂的病因、发病机制与治疗的研究也取得了突破性进展,首先是在20世纪20年代发现了胰岛素,这是对糖尿病病因和治疗史上的一次突破;50年代胰岛素放免测定技术开创了微量激素的测定,大大促进了对DM及各种内分泌疾病的研究;70年代揭示了Ⅰ型DM的免疫机制;80年代随着分子生物学技术的发展和胰岛素基因遗传密码的解密,作为人类历史上第一个生物合成激素——生物合成人胰岛素问世,从而结束了依靠由猪、牛胰脏提取胰岛素的历史。与此同时也大大推动了对DM遗传病因的研究,某些单基因遗传DM的致病基因被查明如MODY、线粒体基因突变DM等。这些成果已集中反映在ADA(1997)和WHO(1999)糖尿病专家组对DM诊断标准和分型的新建议中,但目前对绝大多数(90%)2型糖尿病的复杂病因与发病机制尚未完全了解,DCCT和UKPDS等大型前瞻性临床试验也只说明严格的血糖控制和生化异常的纠正只能部分减少DM血管并发症。因此,DM专家预测21世纪到2025年全球DM的患病人数将继续增加,特别是2型糖尿病将成为包括中国在内的发展中国家的流行病,而糖尿病血管并发症仍将是糖尿病人致残和早亡的主要原因。继往开来如何降低糖尿病发病率和减少糖尿病并发症,仍是广大糖尿病专业工作者面临的主要课题与艰巨任务。在此,我们建议除有条件的单位可继续进行对糖尿病的基础研究外,建议大多数临床医生宜结合自己的工作和条件开展对糖尿病及其并发症防治的临床研究。为此,根据以往来稿中存在的主要问题,我们提出几点意见作为开展糖尿病临床研究的参考: 首先应尽量开展前瞻性研究,既往来稿中回顾性总结多,因此文章中存在资料不完整,标准不一致等问题而影响论文的质量。而前瞻性研究不仅可以避免这些问题,而且可以根据自己的研究目的进行严密的设计,包括研究对象的选择,对照的设立,研究方法和观察指标的选择等,一篇好的论文研究设计本身就等于成功一半。
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“病因选择治疗”:青少年的成人起病型糖尿病开启糖尿病精准医疗时代
青少年的成人起病型糖尿病(MODY),因在胰岛β细胞的发育和成熟中起重要作用的各种转录因子的杂合突变和导致β细胞功能遗传缺陷的葡萄糖激酶(GCK)或胆固醇酯水解酶(CEL)杂合突变所导致。MODY的临床特点是常染色体显性遗传、发病早(通常在25岁以前诊断)、与自身免疫或胰岛素抵抗无关以及内源性胰岛素分泌功能没有完全丧失。除美国糖尿病学会(ADA)命名的7种MODY基因外,近年又新发现6种致病基因包括编码ATP敏感性钾离子通道(KATP通道)的2种基因、胰岛素基因及3种转录因子基因。目前约80%的MODY个体被误诊为1型糖尿病(T1DM)或2型糖尿病(T2DM)[1]。误诊导致误治,从而延误病情、加重糖尿病进展。因此,当需要决策患者的治疗方法、预测其预后以及对患病风险较高的家族成员进行分析和遗传咨询时,正确诊断MODY以及将MODY从T1DM和T2DM中鉴别出来并进行个体化或精准医疗(precision medicine)非常重要。
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解偶联蛋白2调节胰岛β细胞胰岛素分泌的研究进展
糖稳态(glucose homeostasis)对机体的代谢平衡至关重要,主要通过胰腺β细胞对升高的血糖浓度增加相应的胰岛素分泌来实现.当进餐后血糖水平升高时胰岛素分泌随之升高,而空腹时胰岛素分泌受抑.胰岛素基因的转录在维持分泌颗粒中充足的胰岛素储备方面有着重要作用,但对于血糖实时波动的调节,分泌颗粒中胰岛素的释放却依赖一个与糖代谢有关的复杂的信号转导系统.
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特殊类型糖尿病分子病因诊断
在过去的20余年里,糖尿病病因研究进展快的莫过于发现线粒体糖尿病、青少年的成人发病型糖尿病(maturity-onset diabetes of the young, MODY)、胰岛素基因或胰岛素受体基因突变所致糖尿病等等一系列单基因突变糖尿病.1999年WHO将这些单基因突变糖尿病与内分泌病、胰腺外分泌病、药物、感染等所致糖尿病及可能和糖尿病相关的遗传性综合征等归为特殊类型糖尿病.在以往被认为多基因病的2型糖尿病中,有相当一部分被证明是遗传异质性所致,即受单个主基因控制.随着特殊类型糖尿病研究的深入,将为预防、延缓胰岛β细胞功能衰竭和减轻胰岛素抵抗寻求新的治疗方法提供新途径.
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可调控人工β细胞对糖尿病小鼠的治疗作用
用胰腺或胰岛移植以替代被损伤的β细胞是治疗1型糖尿病比较理想的方法,虽然取得了一定的疗效,但由于受供体来源不足、免疫排斥、长期免疫抑制治疗等影响,使其临床应用受到限制.近年来,随着基因重组和转基因技术的迅速发展,再造分泌胰岛素的人工β细胞为糖尿病的治疗提供了新的方向,其中如何保证胰岛素基因在体内适时、适量地表达是实现安全、有效的糖尿病基因治疗的保障.我们在利用四环素Tet-on表达系统建立一株受强力霉素(Dox)调控分泌胰岛素细胞株(tet293/Ins6)[1]的基础上,将细胞移植入动物体内,观察其对糖尿病裸小鼠血糖变化的影响,为糖尿病的基因治疗作进一步尝试.
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长期酒精摄入对大鼠胰岛素分泌功能的影响
目的:研究长期酒精摄入对大鼠血糖、血清胰岛素及胰岛素基因表达影响.方法:清洁级Wistar大鼠80只,雌雄各半,随机分为对照组和低、中、高剂量组,摄入酒精剂量分别为0、0.8、1.6和2.4 g/(kg bw·d).给予酒精18 w后,进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT),第19 w末,断头处死,测定空腹血糖和血胰岛素水平,计算Homa-β功能指数(HBCI).提取胰腺总RNA,半定量RT-PCR测定胰岛素mRNA表达水平.结果:雌性大鼠高剂量组空腹血糖升高、空腹血清胰岛素下降,中、高剂量组HBCI及胰岛素基因表达均降低;雄性大鼠OGTT高剂量组0和1.5 h血糖升高,空腹血糖高剂量组升高,低、中剂量组空腹血胰岛素升高,随着剂量增加,HBCI及胰岛素基因表达先升高后降低.结论:长期高剂量酒精摄入可导致胰岛素mRNA基因表达改变,胰岛β细胞功能受损.
关键词: 酒精 Homa-β功能指数 胰岛素基因 大鼠 -
MODY及其相关基因的研究进展
年轻的成年发病型糖尿病(MODY)是一种常染色体显性遗传的单基因遗传病,它的发生与一定的基因突变相关联.目前已发现至少6种MODY相关基因,即肝细胞核因子-4α(HNF-4α)/MODY1,葡萄糖激酶(GCK)/MODY2、肝细胞核因子-1α(HNF-1α)/MODY3、胰岛素启动因子-1(IPF-1)/MODY4、肝细胞核因子-1β(HNF-1β)/MODY5及MODY6/(BetaA2/NEUROD1),后5种基因均与胰岛素基因的转录调控有关.关建词:MODY;遗传学;基因,肝细胞核因子;基因,葡萄糖激酶
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5 新的糖尿病模型:小鼠胰岛β细胞过度表达ICER的研究(ADA 2001年会,45-OR)
日本的研究者曾报道过转录因子ICER通过竞争性抑制其他的转录激活因子直接与胰岛素基因相结合,有效地抑制胰岛素基因转录.同时,在糖尿病状态下,胰岛内ICER同分异构体的表达增强.因此,他们培育了ICER转基因鼠,发现该鼠可表现严重的高血糖,体重明显低于对照组,胰岛素mRNA的表达与血清胰岛素浓度非常低.口服葡萄糖耐量试验中,ICER转基因鼠胰岛内胰岛素含量是对照组的1/23,不能对葡萄糖刺激产生反应.因此,ICER 可强有力地抑制体内胰岛素基因的转录,引起严重的胰岛素缺乏性糖尿病,增加转录抑制因子可能是其胰岛素mRNA降低的原因.因此,提出该ICER转基因鼠是一种新型的糖尿病动物模型.
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胰岛β细胞自身免疫的分子机制
根据美国糖尿病学会(ADA,1997)和世界卫生组织(WHO,1999)糖尿病分型诊断的新建议,1型糖尿病可分为免疫介导性和特发性两种亚型.遗传易感因素[如人白细胞抗原(HLA)-DQ/DR、胰岛素基因的可变串联重复序列(INS-VNTR)和细胞毒性T淋巴细胞抗原(CTLA)-4等]与环境因素(如病毒感染、饮食成分及化学毒素等)相互作用,致使免疫调节失衡[如辅助性T细胞(Th)1功能亢进,Th2功能减弱等],胰岛β细胞的免疫耐受性丧失而遭受免疫攻击,发生自身免疫性糖尿病.换言之,免疫介导性1型糖尿病系由自身免疫选择性破坏胰岛β细胞,引起胰岛素分泌缺乏所致.
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原发性糖尿病的分子遗传学及研究进展
原发性糖尿病(diabetes mellitus DM)是一种遗传异质性疾病,表现为血糖缓慢增高,尿糖丢失和脂肪分解过度,严重者可出现酮症酸中毒.原发性糖尿病可分为胰岛素依赖性糖尿病(IDDM),非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)2类.前者是由胰岛素分泌的绝对量降低引起,后者是胰岛素正常,但葡萄糖刺激后,胰岛素释放反应降低引起代谢紊乱.大量研究表明,原发性糖尿病由多种遗传因子和环境共同作用而发生.胰岛素基因和其它一些基因可能是糖尿病多基因遗传基础的主要因子,对这些基因结构及其缺陷型与糖尿病的关系、糖尿病的基因治疗的研究成为医学上的热点之一,日益引起人们的重视.
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绿色荧光蛋白和胰岛素基因共表达重组腺病毒载体的构建及感染人脐带间充质干细胞的实验研究
目的 构建同时表达绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因和人胰岛素(insulin,INS)基因的重组腺病毒载体pAdxsi-EGFP-INS,并感染人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs),观察其表达及诱导hUCMSCs成脂分化的作用.方法 用EcoRI/XhoI将胰岛素基因从原始质粒上切下,定向插入至pShuttle-CMV-EGFP穿梭质粒,将验证正确的pShuttle-CMV-EGFP-INS中的EGFP-INS片段转移至pAdxsi载体上,构建pAdxsi-EGFP-INS重组腺病毒载体,用PacI限制性内切酶线性化后转染人胚肾细胞系HEK293细胞,扩增纯化重组腺病毒,测定病毒滴度.原代培养hUCMSCs,分别用pAdxsi-EGFP-INS(感染组)及pAdxsi-EGFP(对照组)腺病毒感染hUCMSCs,观察荧光蛋白的表达情况,成脂诱导剂诱导分化,油红O染色观察胰岛素对hUCMSCs成脂的诱导作用.结果 成功构建pAdxsi-EGFP-INS重组腺病毒载体,包装、纯化后获得滴度达4×1011 pfu/ml的重组腺病毒.分离获得hUCMSCs并传代、纯化,pAdxsi-EGFP-INS感染hUCMSCs后,EGFP-INS在胞浆及胞核表达;成脂诱导培养18 d后,感染组细胞呈现出含有大量小脂滴的脂肪样细胞,而对照组细胞含有少量较大的脂滴,感染组含脂滴的脂肪样细胞数量多于对照组.结论 获得的pAdxsi-EGFP-INS重组腺病毒可高效感染hUCMSCs,为进一步研究胰岛素在干细胞成脂诱导分化中的作用,追踪其在体内、体外表达情况提供了新工具.
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PDX-1与2型糖尿病
胰十二指肠同源框因子-1( PDX-1)是同源盒家族中的一员,其主要功能有指导胰腺的发育和分化,促进胰岛β细胞增殖,抑制胰岛β细胞凋亡,调节胰岛素基因等几个重要的胰岛β细胞特异性基因的转录,对于胰岛β细胞功能的稳定性及糖尿病的发生、进展有十分重要的意义。本文就近国内外有关PDX-1与2型糖尿病的相关性方面的研究进展作一总结,综述如下。
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线粒体基因突变糖尿病临床新进展
迄今己发现了mt基因、胰岛素基因、胰岛索受体基因、葡萄糖激酶基因、肝细胞核因子4α基因、肝细胞核因子1β基因及肝细胞核因子1α基因等单基因突变糖尿病.其中mt基因突变中唯mttRNAlett(UUR)(nt)3243A→G突变所致的糖尿病已为国内外学者所公认,能以简易的分子生物学技术检出,目前己成为首次进入日常临床基因诊断的一种糖尿病亚型.
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线粒体糖尿病概述
近10多年来糖尿病分子遗传学研究得到了迅猛发展,迄今已发现胰岛素基因、胰岛素受体基因、MODY1-6基因所致单基因突变糖尿病等,其中以线粒体基因(mtDNA)突变糖尿病为常见,1997年美国糖尿病学会(ADA)把线粒体糖尿病列为特殊类型糖尿病.在糖尿病人群中发病率为0.5%~1.5%.本文现就线粒体糖尿病目前研究情况作一简要概述.
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类胰岛素生长因子系统与内膜异位症
1类胰岛素生长因子(IGF)的生物化学IGFs是小分子量多肽,IGF-1有70个氨基酸,IGF-2有76个氨基酸[5].两种分子有62%的氨基酸同源性.它们的结构与胰岛素相似,是包括含有3个二硫键桥的多肽链.IGF-1的基因编码区位于12染色体长臂上,含6个外显子;IGF-2的基因编码区位于11染色体短臂上,与胰岛素基因毗邻[1,2].IGF主要合成部位是肝细胞,其合成受GH和营养因子的调节[3].