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自身免疫性疾病患者P D-L1自身抗体的筛查
免疫检查点主要指免疫系统中存在的抑制性免疫调节信号,生理情况下一方面参与维持对自身抗原的免疫耐受,避免自身免疫性疾病,另一方面通过调节外周组织中免疫应答的持续性和强度避免组织损伤[1]。细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4)、程序性死亡受体-1(programmed death-1,PD1)及其配体 PD-L1(programmed cell death-ligand 1)是目前免疫检查点研究的热点分子[2],被认为是免疫调节的主要信号通路。自身抗体是免疫病理调节潜在的调控方式,国外研究主要聚焦于类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA),早期文献报道可以检测到CTLA-4自身抗体[3],近期报道了 RA患者中检出 PD-L1自身抗体[4]。目前国内尚未见相关研究,在其他免疫关联性自身免疫疾病国内外均少有涉及,本研究筛查了多种自身免疫关联性疾病,以及免疫病理为基础的结核病患者PD-L1自身抗体存在状况,明确免疫检查点分子自身抗体调控方式的存在,为研究自身免疫病及免疫关联疾病发病机理、寻求新的治疗策略提供基础研究依据。
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白细胞中与NS5ATP5蛋白结合的蛋白基因的筛选与克隆
目的:采用酵母双杂交体系寻找与NS5ATP5相互作用的白细胞蛋白,以探讨NS5ATP5的生物功能.方法:应用酵母双杂交系统3,构建NS5ATP5诱饵质粒,转化酵母AH109,与含人白细胞cDNA文库质粒的酵母Y187进行配合,于涂有x-α-gal营养缺陷型培养基上筛选生长.挑选蓝色克隆,提取此酵母克隆的质粒转化大肠杆菌提取质粒DNA后进行测序,然后进行生物信息学分析.结果:筛选出10个与NS5ATP5特异性相互作用的克隆,其中1个为金属硫蛋白,1个为热休克蛋白HSP60,1个为主要组织相容性复合体Ⅱ淋巴细胞抗原DQB,5个为人类重排免疫球蛋白λ-轻链,2个是未知功能基因.结论:初步克隆了NS5ATP5与白细胞结合蛋白基因,对NS5ATP5的功能研究有一定的提示作用;为以后研究这些能与NS5ATP5相互作用的基因在白细胞中的生理功能奠定了基础.
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小鼠AFP-CTLA4融合蛋白真核表达载体的构建及鉴定
目的:克隆小鼠甲胎蛋白(mAFP)基因并构建小鼠甲胎蛋白-细胞毒性T淋巴细胞抗原4(mAFP-CTLA4)融合蛋白真核表达载体.方法:从Hepal-6细胞中提取总RNA进行RT-PCR,扩增出mAFP基因,亚克隆于pcDNA3.1载体.PCR法从质粒pmCTLA4-Ig中克隆出mCTLA4膜外部分基因并通过重叠PCR法添加接头,重组连接于pmAFP质粒中mAFP基因后,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆酶切、测序鉴定.用质粒瞬时转染CHO细胞,Westernblot检测融合蛋白的表达.结果:利用RT-PCR从Hepal-6细胞总RNA中成功克隆出1.8kb的nAFP基因;重组阳性克隆经酶切鉴定证实连有接头的CTLA4膜外部分基因已正确插入pmAFP质粒中,测序结果证实各片段连接方向及阅读框正确.用质粒瞬时转染CHO细胞,Western blot检测到预计大小分子量蛋白的表达.结论:mAFP-CTLA4融合蛋白真核表达载体的构建成功,为进一步研究其在肝癌免疫治疗中的作用奠定了基础.
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脐血免疫功能研究进展
免疫系统是机体重要的防御系统,免疫功能低下与多种疾病的发生发展密切相关,故一直是基础医学和临床医学的研究重点.由于在新生儿时期免疫系统并未完全发育成熟,故其功能与儿童及成人有较大差别.近年来,有关新生儿脐血免疫功能的研究取得了很大进展,现对此作一综述.一、脐血的T淋巴细胞亚群脐血的T淋巴细胞数及亚群与成人和儿童有明显不同.早期应用单克隆抗体技术研究人类T淋巴细胞发育,发现随着T淋巴细胞成熟其表面抗原呈规律性表达,功能也随之变化.根据其表型,把T淋巴细胞的发育分为胸腺内和外周血两个阶段.胸腺内的发育分为三个时期,早期胸腺细胞(Ⅰ期)表达T9、T10抗原;普通胸腺细胞(Ⅱ期)丢失T9,获得T6,保留T10,共同表达T4和T8;成熟胸腺细胞(Ⅲ期)则T6消失,获得成熟T淋巴细胞抗原T3,并开始分化为T3+T4+T10+和T3+T8+T10+两个不同功能的细胞群,然后T10丢失进入外周血成为T3+T34+和T3+T8+两个成熟的T淋巴细胞亚群.脐血T3+细胞数较成人外周血少,T6+细胞占10%~15%,T10+细胞数则高达50%以上;成人外周血几乎无T6+细胞,T10+细胞《10%,T4+和T8+细胞的总和基本上等于T3+细胞数.Rabian-herzog等[1]研究表明,脐血淋巴细胞多属幼稚细胞或为处于抑制状态的淋巴细胞.表现为脐血T淋巴细胞白细胞介素2(IL-2)受体及HLA-DR表达明显
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儿童急性淋巴细胞白血病髓系抗原表达的研究
急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)是儿童常见的急性白血病,大多数ALL病人的白血病细胞仅表达淋巴细胞抗原,但也有部分同时表达髓系抗原.在我国已有成人ALL髓系抗原表达的报道[1],儿童ALL同时表达髓系抗原的重要性一直有争议.
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甲氧基聚乙二醇修饰脐血淋巴细胞抗原的实验研究
用甲氧基聚乙二醇(mPEG)修饰脐血单个核细胞,并观察修饰后对淋巴细胞表面某些抗原的遮蔽作用及造血干祖细胞体外集落形成能力的影响.流式细胞仪分析结果表明,修饰后的脐血淋巴细胞CD3、CD4和 CD8抗原与修饰前相比其相对荧光强度明显下降(P<0.01),剂量越大,遮蔽效果越好.当mPEG的浓度达到12mg/ml 时,CD3、CD4和CD8表面抗原被遮蔽达96%以上.用3mg/ml、6mg/ml和12mg/ml mPEG修饰单个核细胞后在体外人干细胞培养基中培养发现,形成CFU-GM的数量分别为 22.83±14.47、 22.67±14.61和25.83±9.99.与对照组(24.00±18.42)相比差异无显著性意义(P>0.05).提示mPEG修饰脐血淋巴细胞后几乎可以完全遮蔽其表面抗原,但不影响干祖细胞在体外的增殖、分化能力.
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生物制剂在风湿性疾病中的应用
生物制剂用于治疗风湿性疾病二十余年已经取了重要的研究成果,并开发出了一系列全新和鼓舞人心的生物制剂,其中包括:①针对促炎细胞因子生物制剂,如已经广泛应用于临床的抗肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)抑制剂(Adalimumab、Etanercept和Infliximab)、白细胞介素(IL)-1受体拮抗剂和抗IL-6受体单克隆抗体;②针对抗B细胞的特异性抑制剂,如已经开发出成品并正在被尝试用于治疗风湿性疾病的抗CD20单克隆抗体Rituximab、抗CD40配体的单克隆抗体、B淋巴细胞刺激因子(BLys)家族的单克隆抗体;③抗T细胞特异性抑制剂,如细胞毒性T淋巴细胞抗原4-免疫球蛋白(Cytotoxic T lymphocyte antigen 4-immuno-globulin,CTLA4-Ig).
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胰岛β细胞自身免疫的分子机制
根据美国糖尿病学会(ADA,1997)和世界卫生组织(WHO,1999)糖尿病分型诊断的新建议,1型糖尿病可分为免疫介导性和特发性两种亚型.遗传易感因素[如人白细胞抗原(HLA)-DQ/DR、胰岛素基因的可变串联重复序列(INS-VNTR)和细胞毒性T淋巴细胞抗原(CTLA)-4等]与环境因素(如病毒感染、饮食成分及化学毒素等)相互作用,致使免疫调节失衡[如辅助性T细胞(Th)1功能亢进,Th2功能减弱等],胰岛β细胞的免疫耐受性丧失而遭受免疫攻击,发生自身免疫性糖尿病.换言之,免疫介导性1型糖尿病系由自身免疫选择性破坏胰岛β细胞,引起胰岛素分泌缺乏所致.
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细胞毒性T淋巴细胞抗原4基因第一外显子多态性在类风湿关节炎发病中的意义
文献报道,细胞毒T细胞抗原4(CTLA4)是一种T细胞活化的重要负调节因子,编码这一蛋白的基因有一定的多态性,并可影响到某些自身免疫病的发病[1]。本文通过对CTLA4基因变异分析,探讨该基因在类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)发病中的意义。1 材料与方法1.1 实验对象中全部RA病例来自我院和解放军总医院风湿科1996.7~1998.12门诊或住院患者,共63例(RA),均符合1987年美国抗风湿联盟(ACR)的诊断标准。另选择60名健康献血员作为对照组。所有受试对象均抽取静脉血2ml。1.2 实验方法1.2.1 酚/氯仿/异戊醇法提纯外周血基因组DNA。1.2.2 CTLA4基因第一外显子+49位等位基因的检测采用PCR-RFLP分析方法[1]。PCR产物阳性条带为162bp。将产物以内切酶BbvI在37℃水浴2h。酶切后显示88bp和74bp2条带型者定为G(Ala),仍显示162bp者定为A(Ihr)。内切酶BbvI和纯合子、杂合子阳性对照标本由德国JohannnWolfgang Goethe大学Badenhoop教授赠送。1.2.3 用组特异性引物扩增DRB1基因第2外显子,筛选DR4阳性标本[2]。1.3 分别计算RA组和对照组CTLA4等位基因A与G、表现型A与G及纯合子、杂合子频率。2个样本率的比较用χ2检验。2 结果2.1 CTLA4等位基因A与G、表现型A和G以及杂合子AG、纯合子AA与GG的频率在RA组和正常对照组之间无显著差异(P>0.05)。2.2 杂合子AG及纯合子AA在DR4+RA组频率分别显著高于和低于DR4+正常对照组(χ2分别为5.84和5.46,P<0.05);表现型G在DR4+RA组显著高于DR4+正常对照组(χ2=5.84,P<0.05)。纯合子GG、表现型A在DR4+RA组和DR4+正常对照组无显著差异。各等位基因频率在DR4-RA组和DR4-正常对照组间也无显著差异。
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戈谢病细胞免疫表型及吞噬功能研究
戈谢病(Gaucher's disease)是一种罕见的脂类代谢异常性疾病,临床资料报道较多,实验室研究资料尚少.我们通过对3例戈谢病骨髓中戈谢细胞的免疫表型及吞噬功能研究,发现戈谢细胞主要表达淋巴细胞抗原,高度表达B淋巴细胞抗原,同时证实戈谢细胞具有吞噬功能.
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TIM3在肿瘤微环境中作用的研究进展
恶性肿瘤严重影响人类健康,目前肿瘤的治疗手段包括放疗、化疗及分子靶向性治疗[1]。细胞免疫系统对肿瘤细胞的杀伤过程包括:肿瘤细胞的识别、肿瘤抗原被呈递给T细胞、T细胞激活及特异性杀伤肿瘤细胞。在这个过程中,T细胞的激活需要协同刺激信号,而这些信号需要“免疫检查点”的调控[2],“免疫检查点”分子研究较多的有:T细胞免疫球蛋白黏液素3( TIM3)、细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)、程序性细胞死亡因子-1(PD-1)及其配体( PD-L1)等,它们在肿瘤微环境的免疫调节中起重要作用,本文将对其在肿瘤微环境中的作用展开综述。
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共抑制分子在脓毒症中的作用研究进展
根据Kevin Lafferty提出的关于T细胞激活的双信号假说, T细胞的激活不仅需要MHC-肽-TCR提供的第一信号,而且需要细胞膜上的共信号分子所传递的第二信号。其中共刺激分子传递正性信号促进T细胞的活化,而共抑制分子将传递负性信号引发T细胞的无应答、耐受或细胞凋亡。近年研究发现,共抑制分子如程序性死亡因子( PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞抗原-4( CTLA-4/CD152)及B/T淋巴细胞弱化因子( BTLA )等在自身免疫性疾病、肿瘤、慢性感染等多种疾病中发挥作用。
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T细胞调节基因CTLA-4与自身免疫性甲状腺疾病遗传易感性
自身免疫性甲状腺疾病(AITD)包括:Graves'病(GD)、桥本氏甲状腺炎(HT)、特发性黏液性水肿(IM)、产后无痛性甲状腺炎综合征(PPT)、甲状腺相关性眼病(TAO)、自身免疫性甲状腺功能减退(AIH)等.AITD是常见的自身免疫病,见于2%~4%的女性以及1%的男性[1].有研究表明,碘、雌激素、钠碘转运体等因素对AITD的发生均有影响[2-4].AITD的发生与遗传有着密切的关系,家族聚集性以及双胞胎研究均表明其有一定的遗传素质.与AITD易感性有关的几种遗传因素已得到证实,包括:人类白细胞抗原(HLA)基因、细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)基因、TSH受体基因以及其他免疫调节基因.近年来随着对CTLA-4基因的深入研究[5],证明其不仅是众多自身免疫病的易感基因,而且在AITD的发生、发展中起着重要作用,本文对此作一综述.
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细胞毒T淋巴细胞抗原-4抗体治疗类风湿关节炎的新进展
在类风湿关节炎的病程中,CD4~+T淋巴细胞被认为扮演了重要的角色~([1]).CD4~+T淋巴细胞激活需要两个信号--识别信号、激活信号.
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T淋巴细胞生与死的决定
目的:T淋巴细胞抗原受体复合物(TCD/CD3)介导的信号传递途径决定其生存与死亡,而TCR的刺激信号是通过CD3各亚基胞内区免疫酪氨酸受体激活基序(ITAM)传递的.国内外和本实验室的一系列研究发现CD3ε-ITAM中的两个酪氨酸(Y170,Y181)对T淋巴细胞的生存与死亡起不同的调节作用,其中任何一个或两个酪氨酸同时突变为苯丙氨酸均可影响T淋巴细胞激活,并阻断T细胞死亡的信号传递.T细胞接受抗CD3抗体刺激后,CD3ε-ITAM的Y170可募集Lck、3-磷酸肌醇激酶的P85α亚基和Shc,而Y181可募集ZAP70与其结合,从而介导不同的信号极联,决定细胞生(激活)或死(凋亡)的不同命运.方法和结果:在CD3ε介导的细胞凋亡过程中,凋亡基因Fas及其配体FasL的表达增加.进一步的研究发现,核转录因子Nur77在细胞激活时表达上调,在细胞接受持续刺激并出现凋亡时,Nur77的表达进一步增加.为阐明Fas、FasL和Nur77三者表达的相关性,建立了稳定表达Nur77的T细胞株,构建了Fas及FasL启动子驱动的荧光素酶报告基因表达载体并转染该细胞株,研究Nur77过量表达对Fas及FasL转录的影响,结果表明Nur77可以上调Fas的表达,但对FasL的表达没有影响.Nur77上调Fas的表达,从而增加了Fas+细胞和细胞凋亡.结论:Nur77具有决定细胞"生"(细胞激活)或"死"(细胞凋亡)的关键作用.
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基于检查点阻断抗体的肿瘤靶向免疫治疗研究进展
免疫肿瘤学在近120年间逐渐形成,肿瘤可以被免疫系统识别,并且在某些情况下,免疫系统能调控肿瘤生长,甚至清除肿瘤。其中调控细胞免疫过程的关键分子成为肿瘤免疫治疗研究的新方向[1]。细胞毒性 T 淋巴细胞抗原-4(CTLA -4)和程序性死亡受体-1(programmed death -1, PD -1)具有负性免疫调节作用,能抑制 T 细胞的免疫应答,被称为免疫检查点(immune checkpoint )。而能阻断这些免疫负调节物的单克隆抗体因其能直接提高 T 细胞的免疫功能获得了广泛关注,这种单克隆抗体现在被称作检查点阻断抗体(checkpoint blocking antibodies )。检查点阻断抗体在临床上的进展是建立在对 T 细胞激活调控机制的基础研究上的。在 T 细胞激活的“双信号”模型中,抗原特异性的 T 细胞激活需要 T 细胞受体(TCR)和共刺激分子 B7-CD28两者的共同参与[2]。随后的研究在此双信号模型的基础上还发现了更多免疫调节信号,包括共抑制分子(CTLA -4、 PD -1、LAG -3)和共刺激分子(GITR、OX40、4-1BB),如何通过调控这些免疫调节信号以强化 T 细胞的抗肿瘤免疫应答将是今后研究的重点。本综述主要关注 CTLA -4、PD -1等免疫抑制性分子的阻断抗体。 CTLA -4能与其配体 CD80(B7-1)和 CD84(B7-2)结合,减弱幼稚 T 细胞和记忆 T 细胞的早期激活[3],而 PD -1主要通过其与配体 PD -L1和 PD -L2的相互作用来调控周缘组织 T 细胞的激活[4]。通过阻断CTLA -4和 PD -1的负调控通路可以强化 T 细胞的免疫应答以治疗肿瘤患者。