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变形链球菌耐酸性缺陷株的构建
变形链球菌(简称变链菌)是主要的致龋菌,耐酸性是其关键的毒力因子,但对其基因调控机制并未明了.本实验欲用转座子Tn917随机诱变变链菌野生株UA159,筛选耐酸性变异的突变株,以便于找到一个与耐酸性相关的调控基因.
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甲壳胺影响变链菌酸性代谢产物的研究
目的:探讨甲壳胺对变形链球菌酸性代谢产物的影响,特别是对乳酸的影响.方法:利用实验室厌氧菌培养法,观察变形链球菌在有或无甲壳胺的培养液中代谢后,总酸量及乳酸量的变化情况.结果:实验组pH值高于对照组(P<0.01),乳酸值低于对照组(P<0.01).实验组中含甲壳胺高浓度组作用强于低浓度组(P<0.05).气相色谱分析可看出,实验组的挥发酸、非挥发酸峰面积小于对照组,乳酸亦然.结论:甲壳胺能使变链菌代谢后的总酸量降低,包括挥发酸和非挥发酸,特别是乳酸.从而为临床上应用其这一特性,抑制菌斑内致龋菌产酸,以达到防龋的目的,提供了有力的实验依据.
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变形链球菌表面蛋白遗传多态性与黏附作用关系的初步研究
表面蛋白P1是人类的主要致龋菌--变形链球菌(以下简称变链菌)重要的毒力因子之一,主要介导变链菌的非蔗糖依赖性黏附.不同菌株的黏附性能不同,而此差异是由其毒力因子遗传变异所决定的.我们通过对变链菌临床分离株表面蛋白P区及V区、C末端编码基因的研究,探讨其遗传多态性与黏附性能的关系.
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含变链菌PAc蛋白编码基因保守区重组质粒pCIA-P的亚克隆构建
人类致龋菌变形链球菌(S.mutans)的一种表面蛋白PAc,由于参与介导细菌对牙面的粘附而被视作S.mutans的重要毒力因子,因此成为研制防龋疫苗的主要备选抗原.我们选择pac基因中编码PAc主要免疫活性区域的DNA序列, 制备出待表达DNA片段, 经亚克隆至pGEM-T质粒后,再克隆到高效哺乳动物表达质粒pCI中构建成含pac基因重要抗原决定簇编码区域的重组质粒,从而为防龋DNA疫苗的免疫实验研究完成了重要准备.
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在大肠杆菌中表达和提取纯化变形链球菌GTF-Ⅰ
葡糖基转移酶是变形链球菌(S. mutans)的重要致龋毒力因子,其中gtfB基因编码的GTF-Ⅰ能够催化水不溶性葡聚糖的合成,介导变链菌与牙面的蔗糖依赖性粘附,在龋病的发生和发展中起重要作用.目前我们已研制了针对变链菌的表面蛋白PAc和GTF的融合防龋DNA疫苗[1],为了进一步鉴定和加强其免疫效果,我们以金属螯合亲和层析法从大肠杆菌中表达、提取和纯化了重组葡糖基转移酶GTF-Ⅰ.
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防龋疫苗主动免疫的现状与未来
防龋疫苗的研究已有近40年的历史,多种防龋疫苗经证实确有防龋效果,然而防龋疫苗进入临床应用前必须解决使用安全性、防龋高效性、成本经济性等问题.近年来,随着免疫学、分子生物学和基因工程技术的飞速发展,从分子水平对变形链球菌 (Mutans Streptococci,以下简称变链菌)主要毒力因子表面蛋白抗原 (surface protein antigen,PAc,又称为抗原B、I/II、IF、P1)和葡糖基转移酶 (glucosyl~transferaes, GTFs)的认识逐步深入,极大地推动了防龋疫苗的研究.国内外学者就防龋疫苗的免疫原、免疫佐剂和免疫途径进行了大量的研究,取得了许多新的进展.
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改性大豆低聚糖及其预防龋齿作用的研究
大豆低聚糖(soybean oligosaccharides)是大豆籽粒中可溶性寡糖的总称,主要成分是水苏糖、棉子糖和蔗糖等[1].改性大豆低聚糖(modified soybean oligosaccharides)是大豆低聚糖经过酶改性的一种新型低聚糖.目前,国内生产大豆低聚糖是加入赋形剂后喷雾干燥制得粉末状产品,该产品中蔗糖的含量高达44%.如此高的蔗糖含量限制了大豆低聚糖在一些功能性食品中使用.以大豆低聚糖中的蔗糖为底物,采用从米曲霉(Aspergillus oryzae)中[2]提取出的β-D-呋喃果糖苷酶(E.C.3.2.1.26),可以有效地将蔗糖水解成葡萄糖和果糖,并将果糖转移到蔗糖分子的果糖残基上通过β(1→2)糖苷键连接1~2个果糖基,形成蔗果三糖和蔗果四糖,该方法可降低糖浆制品中蔗糖的含量,提高低聚糖的含量,可将其中60%的蔗糖转化为低聚糖,使得后产品的纯度接近精制大豆低聚糖.
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天然植物提取物对变链菌胞外多糖的抑制
目的寻找对控制牙菌斑有效的天然植物提取物.方法常规细菌培养,酚-硫酸法测细菌培养液的葡聚糖.结果对水不溶性葡聚糖合成抑制超过40%的有丁香酚,茶多酚,蛇床子素,芦荟甙,齐墩果酸,胡椒碱,三七皂甙,对水溶性葡聚糖合成抑制超过40%的有丁香酚,绿原酸,大黄素,植酸.对水不溶性葡聚糖和水溶性葡聚糖合成抑制的效果相对都比较好的是丁香酚、胡椒碱、茶多酚.结论丁香酚、胡椒碱、茶多酚推荐为进一步开发研究的首选药物,可望在口腔疾病的防治方面发挥作用.
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鼻咽癌病人放疗前后口腔变形链球菌和放线菌构成比的变化
目的探讨鼻咽癌患者(NPC)放疗后变链菌、放线菌的变化。方法选择14例健康人,22例鼻咽癌患者,对健康人及72例鼻咽癌患者放疗前后各个阶段的口腔变形链球菌与放线菌变化进行纵向观察。结果鼻咽癌患者放疗前、放疗结束时与正常人比较、变链菌、放线菌在菌斑微生物中的构成比无显著差异,而放疗后3个月、放疗后6个月与正常人相比,两菌的构成比在统计学上有显著性差异。鼻咽癌放疗前后各阶段变链菌、放线菌在菌斑中的构成比有显著性差异。结论放疗后变链菌的构成比随时间推移呈上升趋势,而放线菌的构成比则随时间推移呈下降趋势。
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唾液对口腔致龋菌粘附力的影响
龋病是口腔科常见的感染性疾病,它的始动因子是细菌借助菌斑在牙面上的粘附和定居,其中以变链菌与龋病的关系为密切,是致龋细菌的优势菌.我们用羟基磷灰石柱层析法层析变形链球菌、远缘链球菌、乳杆菌和粘性放线菌,检测其粘附力的大小,并对其致龋作用的机理进行探讨.
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基因诊断技术在致龋菌检测中的应用
龋病被WHO列为三个重点防治疾病之一.龋病的主要致龋菌为变形链球菌(Streptococcus mutans)属兼性厌氧或微需氧菌,本菌被公认是龋病的主要致病菌,其致龋机制在于该菌能利用宿主口腔中的蔗糖合成葡聚糖,其中一部分为不溶于水的葡聚糖,这种多糖是牙菌斑的主要成份.变链菌可代谢这些多糖产生各种酸,从而使牙齿造成破坏[1].在我国龋病的发病率为40%左右,其主要病原菌-变链菌的检测日益受到人们的关注,传统的病原微生物学检测方法,一般依据细菌的形态,生理生化特性及免疫血清分型,不但准确性差而且费时.
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变形链球菌葡糖基转移酶的分子生物学研究进展
变形链球菌(以下简称变链菌)在代谢过程中产生的葡糖基转移酶(GTF)能利用蔗糖合成胞外葡聚糖,在致龋过程中发挥关键作用.本文就GTF的基因研究、促粘附作用、常用GTF抑制物质以及疫苗研究等进展作一综述.
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银汞合金充填体表面菌斑中变链菌对汞转化的体外研究
目的对银汞合金充填体表面菌斑中变链菌对汞的转化作用进行实验研究.方法分别于银汞充填前和充填后1d、1周、2周、4周和8周采取银汞合金上的菌斑,以未作充填的牙上菌斑为对照,进行菌斑成分分析,从中分离、鉴定出变链菌,取纯分菌落接种于10ml TSB培养肉汤中,培养24h,按100ng/ml 加入汞标,再培养24h送检测汞.结果实验组和对照组的无机汞和有机汞在充填前和充填后各时间点间差异均具有显著性,而充填后各时间点间差异无显著性.实验组和对照组间无机汞和有机汞在银汞合金充填后各时间点上差异无显著性.结论变链菌能将一定量的无机汞转化为有机汞,银汞合金中汞对这种转化有一定的影响.
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乳杆菌和变链菌的产酸脱矿实验研究
乳杆菌和变链菌为牙本质龋中的主要检出细菌,对2种细菌产酸和引起牙本质脱矿能力的研究,有助于了解它们在牙本质龋发生发展中的作用.
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耐氟菌株及其亲代菌株ATP酶基因的DNA测序
目的对变型链球菌耐氟菌株及其亲代菌株的胞膜ATP酶基因进行DNA序列分析.方法分别制备变链菌株Ingbritt及其耐氟菌株Ingbritt-FR的菌悬液(OD600nm=1.0),经溶菌酶、Lysis消化.按已知ATP酶基因引物设计、扩增ATP酶各片段.将ATP酶基因连接至PUCm-T克隆载体,转化后经限制性内切酶酶切鉴定为阳性克隆.采用DG1G1E检测ATP酶基因, DNA测序试剂盒分析DNA序列.结果耐氟菌株与其亲代菌株的核苷酸序列无显著差别.结论 ATP酶基因改变不是变链菌株耐氟突变的机制.
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猛性龋儿童变链菌分离株耐酸性实验研究
目的:确定猛性龋儿童变链菌和远缘链球菌临床株的耐酸性.方法:采用紫外分光光度计比较猛性龋、非猛性龋、无龋儿童变链菌(各6株)和远缘链球菌(猛性龋儿童6株,非猛性龋和无龋儿童各3株)临床株在体外不同初始pH条件下的生长情况.结果:初始pH 4.5~5.5条件下,各组变链菌生长抑制程度均明显大于远缘链球菌(P<0.05).初始pH 4.5条件下,猛性龋儿童远缘链球菌分离株耐酸性明显强于非猛性龋和无龋儿童分离菌株(P<0.05).结论:远缘链球菌的耐酸性强于变链菌;猛性龋儿童远缘链球菌分离株耐酸性强.
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质子通透性与变形链球菌耐酸性关系的研究
变形链球菌(以下简称变链菌)是公认的龋病致病菌,其致龋性除与其对牙面的粘附能力和产酸性有关外,还与其耐酸性密切相关.对致龋菌而言,耐酸性(acid tolerance/acidurance)是指细菌能在低pH 值环境中生长和代谢碳水化合物产酸的性能.致龋菌均能产酸,但并非所有能产酸的细菌均能致龋,因为随着菌斑pH值的降低,一些细菌失去产酸能力,在临界 pH值时,只有少数耐酸的细菌如变链菌和乳杆菌能生长[1].变链菌是菌斑中耐酸的细菌之一,其各遗传种在pH值低至4.0时仍能代谢蔗糖产酸[2,3],而其它很多致龋菌则不能在pH值小于5.0的酸性环境中进行糖酵解.目前关于变链菌耐酸性的研究多集中于以下几个方面.
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变形链球菌GTase高表达株免疫奶牛应用研究
目的:观察防龋疫苗免疫奶牛后,牛乳中特异性抗体的产生规律.方法:应用变链菌GTase-I高表达株免疫怀孕奶牛,收集牛乳,经间接ELISA检测牛乳中特异性抗变链菌抗体.结果:抗变链菌特异性抗体出现于初乳中,其含量于分娩后10d达到高峰,在末次免疫后,特异性抗体可在60d内维持在较高水平.巴氏消毒(62.5℃,30min)对免疫牛乳中IgG活性无明显影响.结论:变链菌GTase高产株可诱导奶牛分泌高效价抗变链菌特异IgG.
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重组葡萄糖基转移酶稳定性研究
目的 探讨影响重组葡萄糖基转移酶GTF生物学活性稳定的因素。方法 变链菌的GTF为预防龋齿的有效抗原,为获得大量GTF纯品,将GTF基因克隆到大肠杆菌,制备重组GTF。结果60℃处理30min,活性几乎完全丧失;其活性适pH为5.5~7.0,适盐离子浓度0.1—0.2 mol/L;液体室温保存20周活性无明显下降;冻干保存,其活性1年内无明显下降。结论 GTF作为免疫预防制剂的生产、保存提供了依据。
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口腔链球菌的耐酸机制
在口腔天然菌群中,链球菌占的比例大,包括血链球菌、轻链球菌、唾液链球菌和变形链球菌(以下简称变链菌)等.口腔链球菌系产酸菌,能很快发酵糖产酸,导致环境pH下降.因此,链球菌在低pH环境中生长及继续代谢碳水化合物产酸是学者们面对的一大问题.本文对各种链球菌的耐酸机制进行综述.