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052 1种新型蜂胶及其化学组分对葡糖基转移酶和变异链球菌生长和黏附的作用
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甜茶护齿含片对口腔几种常居菌的体外实验研究
目的:观察甜茶护齿含片对几种常见口腔常居细菌和白色酵母菌生长的影响.方法:将磨成粉末的甜茶护齿含片,采用二倍稀释法,用TSA培养基,配制成从5.000g/50ml到0.313g/50ml的5个浓度的实验组的含药平板,用加样枪多点加入培养鉴定后配制浓度相当于0.5麦氏标准比浊管的菌悬液(约1-2μl)接种于琼脂平板表面,每点菌数约为104CFU,形成直径为5~8mm的菌斑.接种好后置37℃孵育16-24h,孵育后观察细菌生长情况,以抑制细菌生长的琼脂平板所含低药物浓度为MIC.设立不含甜茶甙的平板做阴性对照.结果:甜茶护齿含片对4种微生物的生长均有一定的抑制作用,不同微生物之间抑制效果不同.随着甜茶护齿含片纸片浓度的逐渐下降,4种不同微生物在各浓度组间的差异均有统计学意义(P <0.05),4种微生物组中,金黄色葡萄球菌对甜茶护齿含片比较敏感,其它3组微生物对甜茶护齿含片均不甚敏感.结论:甜茶护齿含片能不同程度的抑制口腔常居微生物的生长.
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副血链球菌fap1-orf4基因座位编码的GTF和ORF4的功能与相互作用的研究
目的 研究副血链球菌(Streptococcus parasanguis)fap1-orf4基因座位编码的葡糖基转移酶(GTF)和开放阅读框架(ORF)4是否参与菌毛相关蛋白1(Fap1)的糖基化与成熟以及两种蛋白质之间的相互作用.方法 采用基因置换技术构建副血链球菌gtf和orf4突变株,并利用互补分析和Western blot检测副血链球菌Fap1的表达水平,用以评价GTF和ORF4在Fap1的糖基化和成熟的作用,另外采用酵母双杂交技术、GST pulldown技术检测GTF和ORF4两种蛋白质的相互作用.结果 (1)副血链球菌gtf和orf4的突变株呈现相同表型,成熟的相对分子质量(M)约220×103的Fap1被高相对分子质量不成熟的Fap1(Mr约360×103)所取代.互补分析显示pVPT-GFP-gtf和pVPT-GFP-orf4能使突变株恢复表达成熟的Fap1;(2)酵母双杂交技术的划线试验显示共转化子AH109/pAD-gtf+pBD-orf4和AH109/pAD-00f4+pBD-gtf均能在营养缺陷的选择性培养基SD-LTHA上生长,而共转化子AH109/pAD+pBD-orf4、AH109/pAD+pBD-gtf、AH109/pBD+pAD-orf4、AH109/pBD+pAD-gtf不能在营养缺陷的培养基上生长;酵母双杂交技术的X-α-ga1试验显示共转化子AH109/pAD+pBD-orf4和AH109/pAD-orf4+pBD-gtf呈现蓝色.(3)GST pull down技术进一步证实GTF和ORF4两种蛋白质之间存在直接的相互作用.结论 副血链球菌fap1-orf4基因座位编码的GTF和ORF4之间存在相互作用,GTF和ORF4组成复合物是Fap1成熟与糖基化所必需的.
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靶向融合防龋重组质粒pGJA-P免疫定菌鼠的研究
变异链球菌(Streptococcus mutans,S. mutans)是公认的主要致龋菌,细胞表面蛋白抗原PAc和葡糖基转移酶(glucosyltransferases,GTFs)是S.mutans的重要致龋毒力因子.我们构建了同时针对PAc和GTF的融合防龋重组质粒pGLUA-P,经动物实验证实确有防龋作用.Boyle等提出同时表达细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 (cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4,CTLA4)和目的抗原融合蛋白的DNA疫苗能加快和增强免疫反应,原因是通过CTLA4与APC表面的B7结合,目的抗原被靶向引导至APC,从而加强了APC对目的抗原的提呈作用.据此我们在pGLUA-P中引入编码人CTLA4胞外区和Igγ1恒定区的基因,构建出靶向融合防龋重组质粒pGJA-P.本实验用pGLUA-P和pGJA-P重组质粒免疫定菌鼠,观察CTLA4的靶向作用对免疫效果的影响.
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九节茶对变形链球菌体外致龋力的实验研究
目的:观察九节茶提取物对变形链球菌体外致龋力的影响.方法:将不同浓度九节茶提取物加入培养基中进行变形链球菌培养,观察药物不同浓度在培养基中抑菌圈直径、菌细胞数和pH值变化情况以及葡糖基转移酶活性.结果:九节茶可抑制细菌生长、抑制葡糖基转移酶活性等.结论:提示九节茶可影响变形链球菌的致龋作用,可能是一种理想的防龋药物.
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葡糖基转移酶多肽偶联疫苗抗原性
目的:研究人工合成葡糖基转移酶GTF第552~570位的多肽疫苗HDS的免疫原性.方法:将HDS与大分子载体钥孔帽贝血蓝蛋白偶联后,在腮腺区皮下免疫大鼠,取鼠血清,Western blot法检测鼠血清抗GTF抗体.结果:硝酸纤维膜上43KD-66KD间出现强阳性条带,此条带位置与葡糖基转移酶经SDS-PAGE电泳后条带位置一致.结论:抗人工抗原HDS-KLH抗体能与葡糖基转移酶发生抗原抗体反应,抗HDS-KLH抗体具有识别葡糖基转移酶的能力.
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重组变形链球菌葡糖基转移酶催化活性区的活性研究
目的:测定重组变形链球菌GS5葡糖基转移酶GTF(glucosyltransferase)催化活性区的活性.方法:通过异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导含有质粒pET32-NusA-CAT的大肠杆菌,制备可溶性的重组GTF;利用蒽酮硫酸液测定重组GTF与对照样品活性,酶联仪读取OD630数值.结果:蒽酮硫酸液测定重组GTF,对照样品和蔗糖孵育后所得产物OD630数值有明显统计学差异(P<0.05).结论:重组GTF的CAT区具有催化蔗糖生成葡聚糖的生物学活性.
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模拟微重力对变异链球菌gtfs mRNA表达的影响
目的:观察变异链球菌在模拟微重力环境下形态学的变化,及对其葡糖基转移酶基因(gtfs)mRNA表达的影响。方法:采用旋转培养系统(rotary cell culture system,RCCS)建立模拟微重力细菌培养模型,将变异链球菌分为模拟微重力组和对照组。在37℃厌氧环境(80%N2,20%CO2)下培养24h,收集模拟微重力组及对照组菌体,通过扫描电镜、透射电镜观察细菌的形态学变化;并通过Q-PCR方法检测模拟微重力对变异链球菌gtfB,gtfC,gtfD mRNA表达的影响。结果:扫描电镜图片显示,模拟微重力组细菌之间的不定形胶冻样物质明显少于对照组;透射电镜观察显示模拟微重力组细菌的荚膜部分减少,分裂状态下的细菌两极不对称。模拟微重力条件下变异链球菌gtfB、gtfC、gtfD mRNA表达水平呈下降趋势,与对照组之间差异均有统计学意义(P<0.01)。结论:模拟微重力环境下变异链球菌的超微结构有显著改变,对其gtfB、gtfC、gtfD mRNA表达有明显的抑制作用。
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变形链球菌表面蛋白及葡糖基转移酶基因疫苗的防龋动物实验
变形链球菌(S.mutans)是主要的致龋菌,其毒力因子PAc和GTF-B在龋病的发生和发展中有重要的生物学作用.我们利用变形链球菌防龋基因疫苗pcDNA3-pac和pcDNA3-gtfB单独及联合免疫定菌鼠后评价龋损,以初步证实基因疫苗的免疫防龋效果.
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在大肠杆菌中表达和提取纯化变形链球菌GTF-Ⅰ
葡糖基转移酶是变形链球菌(S. mutans)的重要致龋毒力因子,其中gtfB基因编码的GTF-Ⅰ能够催化水不溶性葡聚糖的合成,介导变链菌与牙面的蔗糖依赖性粘附,在龋病的发生和发展中起重要作用.目前我们已研制了针对变链菌的表面蛋白PAc和GTF的融合防龋DNA疫苗[1],为了进一步鉴定和加强其免疫效果,我们以金属螯合亲和层析法从大肠杆菌中表达、提取和纯化了重组葡糖基转移酶GTF-Ⅰ.
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靶向融合防龋DNA疫苗pGJA-P免疫兔的实验研究
目的体外检测靶向融合防龋DNA疫苗pGJA-P的免疫反应性;与非靶向融合防龋DNA疫苗pGLUA-P进行比较,评价其增强疫苗免疫效能的能力.方法将pGJA-P转染CHO细胞,蛋白质免疫印迹实验检测重组蛋白抗体免疫反应性.分5组免疫兔:pGJA-P经肌肉注射组(A组);pGJA-P经鼻黏膜免疫组(B组); pGLUA-P经肌肉注射(C组);pGLUA-P经鼻黏膜免疫组(D组)和pCI载体经股四头肌注射组(E组).酶联免疫吸附实验检测血清及唾液中的特异性抗体.用收集的血清进行葡糖基转移酶(GTF)合成水不溶性葡聚糖抑制实验.结果 pGJA-P表达的重组蛋白可以与抗GTF抗体反应.A组血清特异性IgG抗体水平远高于C组(P<0.01);B组唾液特异性IgA抗体水平显著高于D组(P<0.01);A组同样诱导了高水平的唾液特异性IgA抗体.A组的免疫血清抑制GTF活性的能力强.结论 pGJA-P具备GTF的免疫反应性;并较pGLUA-P有更强的诱导系统和黏膜免疫反应及抑制GTF的能力.
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防龋疫苗主动免疫的现状与未来
防龋疫苗的研究已有近40年的历史,多种防龋疫苗经证实确有防龋效果,然而防龋疫苗进入临床应用前必须解决使用安全性、防龋高效性、成本经济性等问题.近年来,随着免疫学、分子生物学和基因工程技术的飞速发展,从分子水平对变形链球菌 (Mutans Streptococci,以下简称变链菌)主要毒力因子表面蛋白抗原 (surface protein antigen,PAc,又称为抗原B、I/II、IF、P1)和葡糖基转移酶 (glucosyl~transferaes, GTFs)的认识逐步深入,极大地推动了防龋疫苗的研究.国内外学者就防龋疫苗的免疫原、免疫佐剂和免疫途径进行了大量的研究,取得了许多新的进展.
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IPTG诱导变形链球菌葡糖基转移酶可溶性表达及活性初步测定
目的:提取变形链球菌GS5葡糖基转移酶GTF(glucosyltransferase)催化活性区(CAT)的基因,利用IPTG诱导后获得可溶性表达,并检测活性.方法:利用PCR技术克隆CAT的基因片段,通过蛋白重组融合表达技术使其在大肠杆菌BL21中表达,利用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导含有质粒pET32-NusA-CAT的大肠杆菌,SDS-PAGE电泳进行检测;采用蒽酮硫酸法验证活性.结果:成功将CAT基因连入大肠杆菌BL21,获得可溶性的融合蛋白表达;并且融合蛋白具有生物学活性.结论:IPTG成功诱导克隆的变形链球菌葡糖基转移酶催化活性区基因并获得可溶性融合蛋白的表达,具有生物学活性.
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变形链球菌葡糖基转移酶催化活性区的分子克隆及表达
目的:克隆变形链球菌葡糖基转移酶中催化活性区(CAT)的基因片段,并在大肠杆菌中表达.方法:通过PCR技术克隆CAT的基因片段并通过蛋白重组融合表达技术使其在大肠杆菌中表达.结果:成功克隆了CAT的基因片段,并在大肠杆菌中得到其融合蛋白的表达.结论:成功克隆葡糖基转移酶CAT基因并获得其融合蛋白的表达,为后续研究奠定了基础.
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人用靶向防龋DNA疫苗防龋效果及交叉免疫保护的实验研究
变形链球菌( Streptococcus mutans, S.mutans )是主要致龋菌,细胞表面蛋白抗原PAc和葡糖基转移酶(glucosyltransferas, GTFs)是其主要毒力因子.郭继华等构建了以细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4为引导,针对变形链球菌PAc和GTF的靶向防龋DNA疫苗pGJA-P,大大提高了防龋效果[1,2].
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柠檬提取物对变形链球菌葡糖基转移酶和细胞外多糖的影响
目的:探究天然植物成分(柠檬提取物)对变形链球菌葡糖基转移酶和细胞外多糖合成的影响.方法:采用二倍稀释法,用含2%蔗糖的胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)将柠檬提取物稀释为从1.250 μl/ml到0.039 μl/ml共计6个浓度的溶液,以TSB液体培养基作为阴性对照组.加入变形链球菌菌液,采用Neson-Somogyri法测定培养6、18、24、48h培养物中的还原糖含量,计算出酶活性;同时采用蒽酮法测定培养6、18、24、48 h培养物中的水不溶性多糖和水溶性多糖的含量.结果:随着柠檬提取物溶液浓度的升高,葡糖基转移酶活性和细胞外多糖含量逐渐降低,在各个时间点,从0.078μl/ml组到1.250 μl/ml组,各实验组总体均数间均具有显著性差异(P<0.01),各实验组与对照组酶活性、水不溶性多糖含量和水溶性多糖含量都有显著性差异(P<0.01);葡糖基转移酶活性和水不溶性多糖含量之间呈正相关关系(r=0.825~0.963,P<0.01),葡糖基转移酶活性和水溶性多糖含量之间亦呈正相关关系(r=0.815~0.950,P<0.01),且葡糖基转移酶活性与水不溶性多糖含量、水溶性多糖含量的相关性具有显著性差异(t=4.37,P<0.01).结论:柠檬提取物对变形链球菌葡糖基转移酶和细胞外多糖的合成具有显著抑制作用.
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变形链球菌葡糖基转移酶的分子生物学研究进展
变形链球菌(以下简称变链菌)在代谢过程中产生的葡糖基转移酶(GTF)能利用蔗糖合成胞外葡聚糖,在致龋过程中发挥关键作用.本文就GTF的基因研究、促粘附作用、常用GTF抑制物质以及疫苗研究等进展作一综述.
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056 源于葡糖基转移酶的功能性和表位性互补肽的双表位构建物的免疫原性和反应性及预防龋齿的保护作用
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变形链球菌葡糖基转移酶gtfB/CAT真核表达质粒的构建及表达
目的:构建变形链球菌葡糖基转移酶催化区(gtfB/CAT)真核表达质粒(pVAX1-gtfB/CAT),并观察其在哺乳动物细胞COS-7中的表达.方法:通过基因重组技术构建pVAX1-gtfB/CAT;通过脂质体转染法,将其转染至COS-7细胞中,然后以免疫组化SABC法检测其在细胞中的表达.结果:pVAX1-gtfB/CAT经酶切分析证实携带gtfB/CAT片段;pVAX1-gtfB/CAT转染的细胞胞质呈褐色染色,pVAX1空质粒转染的细胞胞质中无着色.结论:成功构建防龋基因疫苗pVAX1-gtfB/CAT,所携带的基因序列正确,能够在真核细胞COS-7中正确表达目的蛋白.
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白屈菜红碱对变形链球菌葡糖基转移酶和细胞外水不溶性多糖的影响
目的:研究白屈菜红碱对变形链球菌葡糖基转移酶和细胞外水不溶性多糖合成的影响.方法:采用二倍稀释法,用含2%蔗糖的脑心浸萃液肉汤琼脂(BHI)液体培养基,将白屈菜红碱稀释为从390.6μ/ml到24.4μg/ml共计5个浓度的溶液,以BHI液体培养基作为阴性对照组.加入变形链球菌菌液,厌氧培养24h后,将培养物离心,收集上清液,分为2份.一份提取葡糖基转移酶,采用考马斯亮蓝法和Somogyi法分别测定总蛋白和还原糖含量,计算酶活性和比活力大小;另一份上清液采用蒽酮法测定水不溶性多糖的含量.实验结果采用SPSS13.0软件包进行数据处理,总体均数之间的比较采用单因素方差分析,采用Pearson相关检验进行两组样本之间的相关分析.结果:随着白屈菜红碱溶液浓度的升高,葡糖基转移酶活性和水不溶性多糖含量逐渐降低,各组总体均数间均具有高度显著性差异(P<0.01),葡糖基转移酶各实验组与对照组酶活性及比活力之间均有高度显著性差异(P<0.01);除24.4μg/ml浓度组外,各实验组与对照组水不溶性多糖含量也均有高度显著性差异(P<0.01).葡糖基转移酶活性和水不溶性多糖含量之间呈正相关关系(r=0.883,P<0.01).结论:白屈菜红碱对变形链球菌葡糖基转移酶和细胞外水不溶性多糖的合成具有显著抑制作用.