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靶向融合防龋重组质粒pGJA-P免疫定菌鼠的研究
变异链球菌(Streptococcus mutans,S. mutans)是公认的主要致龋菌,细胞表面蛋白抗原PAc和葡糖基转移酶(glucosyltransferases,GTFs)是S.mutans的重要致龋毒力因子.我们构建了同时针对PAc和GTF的融合防龋重组质粒pGLUA-P,经动物实验证实确有防龋作用.Boyle等提出同时表达细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 (cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4,CTLA4)和目的抗原融合蛋白的DNA疫苗能加快和增强免疫反应,原因是通过CTLA4与APC表面的B7结合,目的抗原被靶向引导至APC,从而加强了APC对目的抗原的提呈作用.据此我们在pGLUA-P中引入编码人CTLA4胞外区和Igγ1恒定区的基因,构建出靶向融合防龋重组质粒pGJA-P.本实验用pGLUA-P和pGJA-P重组质粒免疫定菌鼠,观察CTLA4的靶向作用对免疫效果的影响.
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防龋疫苗主动免疫的现状与未来
防龋疫苗的研究已有近40年的历史,多种防龋疫苗经证实确有防龋效果,然而防龋疫苗进入临床应用前必须解决使用安全性、防龋高效性、成本经济性等问题.近年来,随着免疫学、分子生物学和基因工程技术的飞速发展,从分子水平对变形链球菌 (Mutans Streptococci,以下简称变链菌)主要毒力因子表面蛋白抗原 (surface protein antigen,PAc,又称为抗原B、I/II、IF、P1)和葡糖基转移酶 (glucosyl～transferaes, GTFs)的认识逐步深入,极大地推动了防龋疫苗的研究.国内外学者就防龋疫苗的免疫原、免疫佐剂和免疫途径进行了大量的研究,取得了许多新的进展.
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人用靶向防龋DNA疫苗防龋效果及交叉免疫保护的实验研究
变形链球菌( Streptococcus mutans, S.mutans )是主要致龋菌,细胞表面蛋白抗原PAc和葡糖基转移酶(glucosyltransferas, GTFs)是其主要毒力因子.郭继华等构建了以细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4为引导,针对变形链球菌PAc和GTF的靶向防龋DNA疫苗pGJA-P,大大提高了防龋效果[1,2].
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防龋基因疫苗pcDNA3-PAc兔鼻腔黏膜免疫防龋的实验研究
目的:观察防龋基因疫苗pcDNA3-PAc经鼻腔黏膜免疫日本长耳大白兔后的免疫反应性,确定不同剂量质粒pcDNA3-PAc免疫机体后的抗体效价.方法:30只日本长耳大白兔随机分为5组,每组6只,分别为200、400、600 μgpcDNA3-PAc质粒组;400 μg pcDNA3质粒组(阴性对照组);灭活全菌疫苗组(阳性对照组).质粒组及全菌组以1∶1比例添加弗氏佐剂后进行免疫,共免疫2次.采用间接ELISA法检测血液、唾液中特异性IgG、S-IgA抗体.采用SPSS17.0软件包对数据进行统计学分析.结果:①血液、唾液中抗体高峰时间为初始免疫后8～10周左右;②自免疫后第3周开始,200、400、600 μg组兔血清、唾液中特异性抗PAc的IgG、SqgA抗体水平与阴性对照组相比,差异有显著性(P＜0.05);③200 μg组与400 μg及600 μg组相比,多时间点差异有显著性(P＜0.05).结论:①防龋基因疫苗pcDNA3-PAc具有免疫反应性,可诱导免疫反应长达14周;②200、400、600 μg的防龋基因疫苗pcDNA3-PAc对体重1.5 kg左右的兔都是有效的免疫剂量;③在本研究条件下,400、600 μg疫苗组效价优于200 μg组.
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变形链球菌表面蛋白编码基因载体质粒pMD-pac构建
目的:获取变形链球菌国内临床株表面蛋白PAC编码基因pac并构建载体质粒,为构建植物表达基因载体做前期准备.方法:以国内检出率高的变形链球菌临床分离株(血清c型)的基因组DNA 为模板,通过PCR扩增获取表面蛋白PAc编码基因pac;通过T-A 克隆构建中间载体pMD18-pac 质粒,对其分析鉴定.结果:目的基因成功的连接到中间载体上.结论:获取的目的基因经测序和比对表明,其与变形链球菌表面蛋白的相关编码基因在核苷酸序列和蛋白同源性上都很高,可以作为抗原基因进一步研究.
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刚地弓形虫表面抗原研究进展
刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种细胞内寄生原虫，可感染任何有核细胞，无论人或动物，感染率都很高。和其它细胞一样，弓形虫的表膜具有重要的作用，既是虫体与外界环境进行物质交换的界面，也是宿主免疫系统识别并杀伤虫体的主要部位。Handman，Goding和Remington(1980)首先对弓形虫表面抗原进行了分析，其后Johnson(1983)、Dubremetz(1985)、Rodriguez(1985)、Kasper(1982，1984，1987)亦对一些表面抗原进行了研究，虽然已发现的抗原种类很多，但由于技术方法差异，命名很混乱。G.Couver(1980)利用单克隆抗体技术对表面抗原进行了确认。随着分子生物学技术的发展，目前对表面抗原的研究已深入到基因水平，已能对编码P30、P22和P43的基因进行克隆和测序。本文将对近年来弓形虫表面抗原的研究进展作如下综述。1 速殖子的表面抗原1.1 蛋白抗原目前已知的速殖子表面蛋白抗原有五种，根据SDS-PAGE中显示的分子量大小，分别命名为P43、P35、P30、P23和P22[1-4]。编码P30抗原的基因首先被克隆、测序，根据分子遗传学的传统命名方法，编码P30的基因被称为SAG〔s〕。随后，编码P22和P43的基因相继被克隆和测序，依次命名为SAG2和SAG3。至今编码P23和P35的基因仍无法克隆、测序。SAG1、SAG2和SAG3的克隆均采用特异抗体和相关抗原对表达文库进行筛查的传统方法所得，三者具有一些明显特点：
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单克隆抗体对茸毛链球菌主要表面蛋白的免疫定位观察
目的:研究所制备的单抗与其相应的非变性抗原PAg的反应,并直观显示PAg在茸毛链球菌原位的分布.方法:采用间接免疫金标技术,通过透射电镜观察,并设置多抗以及变形链球菌和鼠链球菌作为对照.结果:抗PAg的单抗可与茸毛链球菌发生反应,与变形链球菌反应不明确,与鼠链球菌不发生反应.结论:所制备的单抗能与PAg特异性结合,PAg可能与茸毛链球菌表面茸毛层相关.
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表面蛋白抗原防龋疫苗研究进展
表面蛋白抗原是变形链球菌组的主要毒力因子之一,已成为防龋疫苗的主要研究对象,现将表面蛋白抗原防龋疫苗的研究进展综述如下.
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携带变形链球菌表面蛋白、葡聚糖结合蛋白及信号肽基因的真核表达质粒的构建
目的 通过构建带有变形链球菌表面蛋白SpaP的P区、葡聚糖结合蛋白A葡聚糖结合区(glucan binding domain,GBD)及一段信号肽基因的嵌和体真核表达质粒pSSG,为基因疫苗的制备提供实验基础.方法 通过PCR扩增,获得分别编码SpaP的P区和GBD的两个基因片段sp和gg,以及人白介素2信号肽基因(signal).将它们分别定向插入pMD20-T克隆载体中,转化感受态大肠杆菌DH5α,挑取阳性克隆,初步鉴定后测序.将获得的3个基因片段分别双酶切,胶回收纯化后将同样进行双酶切的pVAX1质粒在T4 DNA连接酶作用下进行连接反应,获得真核表达质粒pSSG,并转化DH5α,提取纯化pSSG,进行质粒RCR,酶切电泳鉴定并测序.结果 真核表达质粒pSSG构建正确,目的 基因sp、gg和signal 定向插入至真核表达载体.结论 真核表达质粒pSSG包含了SpaP的P区和GBD以及人白介素2信号肽的编码基因,为基因疫苗研究奠定基础.
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口腔链球菌表面蛋白抗原Ⅰ/Ⅱ的三维结构和相关功能
表面蛋白抗原Ⅰ/Ⅱ（AgⅠ/Ⅱ、P1、PAc、SpaP、SspA、SspB等）广泛存在于口腔链球菌细胞壁表面，介导变异链球菌、表兄链球菌、格登链球菌等口腔链球菌与牙表面的黏附，影响牙菌斑的形成，是影响龋病形成和发展的主要毒力因子之一。自有研究报道了变异链球菌表面蛋白抗原Ⅰ/Ⅱ的V区(SpaP-V)晶体结构之后，陆续有其AgⅠ/Ⅱ的三维结构、格登链球菌V区（SspB-V）的三维结构和C末端（SspB-C）的三维结构见诸报道，逐步揭示了口腔链球菌表面蛋白抗原Ⅰ/Ⅱ的三维立体结构，进一步解释了其功能机制。本文就口腔链球菌表面蛋白抗原的三维结构和相关功能表位的研究情况作一综述。
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变异链球菌黏附机制的研究进展
变异链球菌对牙面的黏附,是形成牙菌斑的前提和致龋的重要条件.分子生物学技术的不断进步使针对变异链球菌黏附机制的研究进入了分子水平,旨在更好地诠释变异链球菌在致龋过程中的作用,为龋病的防治奠定基础.本文就黏附、变异链球菌表面成分与黏附的关系、影响变异链球菌黏附的环境因素、变异链球菌黏附研究的前景展望等作一综述.
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变形链球菌表面蛋白真核表达质粒pcDNA3/pacA和pcDNA3/pacP在哺乳动物细胞中的表达
目的:研究变形链球菌表面蛋白真核表达质粒pcDNA3/pacA 及pcDNA3/pacP在哺乳动物细胞中的转录及表达情况。方法:利用脂质体介导的转染技术，将真核表达质粒pcDNA3/pacA 及pcDNA3/pacP分别转染COS-7细胞，1mg*ml-1 G418加压筛选获取稳定转染的COS-7细胞之后，采用RT-PCR法、LSAB法、流式细胞术及Western印迹法，对真核表达质粒中插入基因pac-A和pac-P的转录及表达产物进行检测。结果:真核表达质粒pcDNA3/pacA及pcDNA3/pacP的插入基因在导入哺乳动物细胞后具有转录和翻译活性，表达的蛋白质产物可位于胞内、胞膜及胞外。结论:构建的真核表达质粒pcDNA3/pacA 和pcDNA3/pacP能在哺乳动物细胞中表达插入基因所编码的蛋白质，为进一步的动物实验提供了实验依据。
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经鼻腔黏膜免疫途径投递防龋DNA疫苗的研究进展
20世纪90年代以来,因DNA疫苗具有其它疫苗不可比拟的优点——免疫原性强,制备简单,免疫应答持久,安全等特点,成为防龋疫苗的研究热点.为寻找免疫防龋的佳途径,国内外许多学者在多种免疫方法和途径上进行了研究.唾液是口腔局部抗卷染的重生理屏障.以分泌型IgA (sIgA)作为主体液防御因子的黏膜免疫系统是机体抗感染的第一道防线,在抵抗感染方面起着极其重的作用.而且实验证明通过黏膜免疫之后,黏膜局部的抗体比血清抗体出现早、效价高,且维持时间长.鼻腔免疫它不仅能避免肝脏的首过效应,有效地诱导黏膜局部免疫和系统免疫应答,具有远隔共同黏膜效应,而且与其它免疫途径相比更加简便、安全、文明,无创伤.近年来鼻黏膜途径受到了基因免疫与基因治疗领域的广泛关注,因而对经鼻腔黏膜途径免疫的方式进行深入的研究,对将来防龋DNA疫苗的临床应用具有重的意义.
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防龋基因疫苗pcDNA3- PAc不同途径免疫BALB/c小鼠的实验研究
目的:观察防龋基因疫苗pcDNA3- PAc经不同途径免疫BALB/c小鼠后的免疫效果.方法: 重组质粒pcDNA3- PAc经颌下腺区皮下注射、股四头肌注射和鼻腔黏膜滴注免疫BALB/c小鼠,共免疫2 次,每次间隔2 周.分别于首次免疫前1 d和免疫后第1、2、4 周采集血液和唾液样品,采用酶联免疫吸附方法检测血清特异性IgG抗体和唾液特异性IgA抗体.结果: 各实验组免疫后1 周血清和唾液中特异性抗体水平开始升高,第4 周时达高水平.颌下腺区皮下注射免疫产生的唾液IgA和股四头肌注射免疫诱导的血清IgG抗体水平明显高于其它实验组(P<0.05).颌下腺区皮下注射免疫和鼻腔黏膜滴注免疫可诱导较高水平的唾液IgA和一定水平的血清IgG;股四头肌注射免疫诱导的血清特异性IgG抗体水平较高(P<0.05),而唾液IgA抗体水平不如颌下腺区皮下注射免疫和鼻腔黏膜滴注免疫(P<0.05).结论: 防龋基因疫苗pcDNA3- PAc能够诱导动物机体产生有效的系统免疫应答和黏膜免疫应答.
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变形链球菌表面蛋白真核表达质粒pcDNA3/pacA及pcDNA3/pacP免疫动物实验研究
目的:探讨变形链球菌表面蛋白真核表达质粒pcDNA3/pacA及pcDNA3/pacP作为基因疫苗,在BALB/c小鼠中的特异性体液免疫应答.方法:将真核表达质粒pcDNA3/pacA及pcDNA3/pacP分别肌注免疫BALB/c小鼠,用间接ELISA法检测小鼠血清抗PAc抗体滴度.结果:真核表达质粒pcDNA3/pacA免疫组的6只小鼠于首次免疫的第4周全部出现抗体阳转,真核表达质粒pcDNA3/pacP免疫组6只中有4只在第4周出现抗体阳转.结论:真核表达质粒pcDNA3/pacA和pcDNA3/pa cP肌注免疫BALB/c小鼠可诱导体液免疫应答.
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嵌合体真核表达质粒pVAX1-SPG的构建及表达研究
目的：构建含变异链球菌表面蛋白SpaP的P区编码基因spap-P和葡聚糖结合蛋白GbpA的葡聚糖结合区编码基因gbd的嵌合体真核表达质粒pVAX1-SPG,并观察其在哺乳动物细胞293T中的表达。方法：通过基因工程技术构建嵌合体真核表达质粒pVAX1-SPG,并采用脂质体转染法将其转染至293T细胞中；然后分别采用免疫组化SABC法和Western-blot检测嵌合蛋白SpaP/P-GBD在真核细胞中的表达。结果：重组真核表达质粒pVAX1-SPG经酶切、测序鉴定证实,其所携带的外源基因片段为2.4 kb的目的基因片段,序列同源性为99%；免疫组化染色结果显示,经pVAX1-SPG转染的293T细胞胞质呈棕褐色染色；Western-blot检测结果显示,分子量为72 kDa的嵌合蛋白SpaP/P-GBD能够被正确表达。结论：构建成功的嵌合体真核表达质粒pVAX1-SPG能在真核细胞293T中正确表达目的蛋白。
