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MALDI-TOF MS技术在快速鉴别肺炎链球菌与口腔/缓症链球菌中的应用
目的 应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)快速鉴别肺炎链球菌与口腔/缓症链球菌.方法 收集2013年4月至2016年12月南京医科大学附属苏州医院和苏州大学附属儿童医院临床分离的110株肺炎链球菌和108株口腔/缓症链球菌,并选择肺炎链球菌ATCC49619作为质控菌株,以菌落形态、奥普托欣敏感性试验、胆汁溶菌试验及PCR法检测lytA、spn9802和recA等基因作为判定菌株鉴定结果的参考方法.应用MALDI-TOF MS对所有菌株进行鉴定.选取其中的143株细菌(73株肺炎链球菌和70株口腔/缓症链球菌)作为模型建立菌株,选取剩余的76株细菌(38株肺炎链球菌和38株口腔/缓症链球菌)作为模型验证菌株.采用ClinProTools软件对所有细菌的质谱图谱进行分组统计分析.结果 通过GA、SNN和QC算法得出的敏感度均大于95%,而特异度均为100%.3种算法显示,质荷比为3443、4990、6956和9949 m/z的质谱峰是用于区分肺炎链球菌与口腔/缓症链球菌为主要的特征性峰,其对应的曲线下面积(AUC)分别为0.884、1、0.999和0.972.峰统计图显示,肺炎链球菌组的3443、4990和9949 m/z峰的强度高于口腔/缓症链球菌组,而6956 m/z峰的强度低于口腔/缓症链球菌组.外部验证显示,除GA模型对肺炎链球菌组和口腔/缓症链球菌组的鉴定正确率分别为97.37%和100.0%,其余2种模型(SNN和QC)对两组细菌的鉴定正确率均为100.0%.结论 MALDI-TOF MS联合ClinProTools可快速准确地鉴别肺炎链球菌与口腔/缓症链球菌,具有高敏感度、高特异度等特点,可为临床诊断肺炎链球菌感染节约时间.
关键词： 肺炎链球菌 口腔链球菌 光谱法 质量 基质辅助激光解吸电离 -
儿童口腔正常微生物群早期定植研究概述
口腔生态系由众多大小不一、结构不同、功能各异的生态区组成,生态区是生物体生存的环境区,作为一个生态空间层次,生态区又包括一些亚结构,即生态位点.口腔微生物群是口腔生态系的主要组成部分,口腔生态区内适宜的温度、湿度和营养源,以及复杂的生态空间特点给微生物的定植和生长繁殖提供优良的条件,因此口腔微生物不仅数量多而且种类复杂.口腔正常微生物群是微生物与宿主在共同的历史进化过程中经过自然选择形成的微生物群体,包括口腔土著微生物群(indigenous microflora,又称为常住微生物群,resident microflora)、外籍微生物群(allochthonous microflora)及过路微生物群(transient microflora),口腔土著微生物群以数量上的优势与宿主适合并与宿主间呈稳定的相互关系,其成员多为口腔链球菌、放线菌和奈瑟菌;外籍微生物群在口腔微生物群中以低数量存在,当环境改变时可成为常住微生物,其成员包含大多能起致病作用的常住菌;过路微生物群不具备与口腔环境抗争的机制,仅短暂停留于口腔,如在新生儿口腔中检出的棒状菌和肠球菌.
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经放射线照射后口腔链球菌的分子生物学鉴定
通过生理、生化试验可对口腔及咽喉部的97.9%的口腔链球菌分离株做出鉴定.但是对一些生长缓慢的细菌,或表型特征介于两个种之间的菌株,只靠生化试验不能明确鉴定到种.而分子生物学鉴定方法如16S rDNA序列同源性分析可将细菌准确、快速地鉴定到种.我们采用16S rDNA序列同源性分析的方法对放疗后生化试验表型发生变化的菌株进行了鉴定.
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万古霉素致中性粒细胞减少症一例报告
患者女,35岁,因间断发热伴咳嗽1个月,加重7d,于2003年12月26日入院.患者于2003年11月出现发热,体温40℃,伴于咳,活动后气促,于外院治疗后热退,仍有干咳、气促.12月20日再度发热,咳嗽加重,伴大量黄黏痰.查体:双肺底可闻及较多湿哕音及痰鸣音.X线胸部检查示双肺纹理增重,呈磨玻璃样改变,两肺均可见小斑点状模糊阴影.血常规:WBC 12.8×109/L,中性0.84.诊断为双侧肺炎(细菌性).先后给予头孢呋新、左旋氧氟沙星、红霉素、头孢他啶.2004年1月11日支气管镜单套刷培养为口腔链球菌(血链球菌Ⅱ型),对去甲万古霉素、头孢三嗪敏感.换用万古霉素500mg静脉滴注,2次/d、头孢曲松钠2.0g静脉滴注,2次/d.患者热退,咳喘减轻,肺内哕音减少,血WBC 5.0×109/L,中性0.62,X线胸部检查示双肺炎症明显吸收好转.1月18日停用头孢曲松钠.1月21日患者再度发热,体温40℃,无其他不适,听诊:肺内少许湿哕音,胸部X线检查示感染病灶进一步吸收.1月23日血常规WBC 1.7×109/L,中性0.33,停用万古霉素,改左旋氧氟沙星,并予升白安口服.1月24日患者体温正常.1月27日查WBC为4.8×109/L.
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氧对口腔链球菌产生过氧化氢的影响
目的观察环境中氧含量对口腔链球菌过氧化氢产生速率的影响.方法采用ABTS-HRP微量板法测定在不同氧含量条件下口腔链球菌过氧化氢产生的速率.结果口腔链球菌在严格厌氧条件下过氧化氢产生速率为9.29 nmol/(min×109细胞);当氧含量增高,口腔链球菌过氧化氢合成速率加快;在不同氧含量的环境中口腔链球菌产生过氧化氢的速率差异存在显著性:有氧振荡培养＞有氧静置培养＞厌氧(P＜0.05).结论环境中氧含量是影响口腔链球菌过氧化氢产生速率的重要因素.
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过氧化氢与口腔菌斑微生态学研究进展
1 产生H2O2菌斑微生物1923年,Mclead和Gorden首先报道肺炎链球菌能产生H2O2,后来学者们又相继发现β溶血性链球菌和乳杆菌也能产生H2O2[1].尽管口腔菌斑细菌种类多,数量大,但目前发现能产生H2O2的微生物主要局限于α-溶血性链球菌.后一项研究利用超细胞生物化学的方法在龈上菌斑和牙周病变部位的龈下菌斑中观察到一些产生H2O2细菌,发现H2O2主要存在于细菌的胞膜和胞质中[2].由于培养条件,外源性糖的种类及浓度和采用检测方法不同,有关口腔能产生H2O2细菌种类的报道存在差异,但就产生H2O2能力而言,以口腔链球菌(Streptococcus oralis)产生能力强,血链球菌(Streptococcus sanguis)次之.
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血链球菌在不同牙周状态下的分布及相关研究
目的:探讨口腔主要过氧化氢产生菌血链球菌和口腔链球菌在不同牙周健康状态下龈下菌群中的分布,及与牙周健康状态和牙龈卟啉单胞菌在龈下菌群中分布的相互关系.方法:纳入符合标准的受试者30人,受试位点86个.其中健康组11人,位点30个,龈炎组9人,位点29个,慢性牙周炎组10人,位点27个,检查记录牙周健康状态[包括牙龈指数(GI)和牙周袋深度(PD)],采集龈下菌斑标本,经厌氧菌培养基和AP-PCR及PCR鉴定后,将各受试组进行比较分析.结果:共获得草绿色链球菌523株,产黑色素菌241株.经AP-PCR及PCR鉴定后,得到血链球菌112株,口腔链球菌56株,牙龈卟啉单胞菌84株.健康组龈下菌斑中血链球菌、口腔链球菌和牙龈卟啉单胞菌构成比与牙周炎组相比有差异显著性;血链球菌和口腔链球菌与GI、PD呈负相关,牙龈卟啉菌与GI、PD呈正相关;血链球菌和口腔链球菌的构成与牙龈卟啉单胞菌的构成比呈负相关.结论:血链球菌等过氧化氢产生菌在龈下菌斑中比例的下降,可能是微生态失衡、致病菌过度增殖的重要机制.
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铍对口腔链球菌生长及粘附性能的影响
目的 研究铍离子(Be2+)对口腔链球菌的生长及粘附性能的影响,探讨口腔修复治疗后牙周损伤的微生物机制.方法 含有不同浓度Be2+(5、10、20和40 mg/L)的培养液厌氧培养口腔链球菌24h.检测不同浓 度Be2作用后细菌形态和菌落形成单位(CFU),以及口腔链球菌在唾液包被羟基磷灰石微粒表面的粘附抑制率.结果 铍离子作用后口腔链球菌长链缩短,菌体出现集结趋势.20 mg/L时,菌体表面出现“触角样”变化.随Be2+浓度增加,CFU值减小(P＜0.05),口腔链球菌生长抑制.各实验组口腔链球菌粘附抑制率高于阳性对照组(P＜0.05),但各Be2+浓度组之间粘附抑制率差异无统计学意义(P＞0.05).结论 铍离子抑制口腔链球菌的生长和在牙面的粘附,可能会导致修复体周围正常微生态环境失衡,引起牙周疾病.提示临床应尽量选用理化性能稳定的修复材料.
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不同牙周状态下分离的血链球菌和口腔链球菌H2O2产生能力的比较
目的:比较研究不同牙周状态下分离的血链球菌和口腔链球菌过氧化氢(H2O2)产生能力.方法:随机选出不同牙周状态下分离的血链球菌和口腔链球菌各30株,采用酚红还原-微量板法测定厌氧条件下两种细菌H2O2的产量.结果:血链球菌各组和口腔链球菌各组H2O2的产量差异未见显著性;口腔链球菌产生H2O2的能力强于血链球菌.结论:提示牙周病变部位与健康部位的血链球菌和口腔链球菌产生H2O2的能力基本相似,是否存在基因型的差异尚待进一步研究.
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口腔链球菌遗传型和表型的研究进展
口腔链球茵包括许多菌种，许多菌种包括广泛的遗传型克隆株。丰富的遗传型和表型对菌种的定植、生存有着独特的意义，既是形成正常口腔生态系统的基础，也是导致疾病的根本原因。本文就目前遗传型和表型的研究状况作一概述。
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铍对口腔链球菌细胞膜元素含量及过氧化氢产量的影响
目的:研究铍离子(Be2+)对口腔链球菌细胞膜元素含量及抗菌性能的影响,探讨镍铬合金修复体对牙周损伤的微生物学机制.方法:含有不同浓度(5mg/L、10mg/L、20mg/L和40mg/L)Be2+的口腔链球菌培养液厌氧培养24h.X线能谱仪分析细胞膜元素含量变化,ABTS-HRP法检测细菌产生H2O2的能力.采用SPSS11.0软件包对数据进行单因素方差分析.结果:口腔链球菌细胞膜钙元素含量减少,钠元素先升高后降低,磷元素升高.Be2+浓度为40mg/L时,口腔链球菌H2O2产量显著下降(P＜0.05).结论:Be2+会改变口腔链球菌细胞膜元素含量,降低H2O2产量,从而导致修复体周围正常微生态环境失衡,引起牙周疾病.
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从肝硬化病人血液中检出口腔链球菌
1 病例摘要患者男,47岁.1998年9月因呕血收入我院诊断为肝硬化.于10月27日进行治疗(对食管静脉曲张,用胃镜治疗).29日患者突然发高热,体温:39.2 ℃,心率92次/分,WBC:22.1× 109/L,N:0.9.当即抽血做血培养,结果为Streptococcus oralis(口腔链球菌) .临床根据药敏结果,用头孢三嗪治疗,病人体温恢复正常.
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口腔链球菌和变形链球菌耐酸相关基因ffh的同源性分析
目的 检测口腔链球菌中是否存在耐酸相关基因,并对口腔链球菌和变形链球菌的ffh同源性进行分析.方法 厌氧培养变形链球茵和口腔链球菌,试剂盒提取细菌基因组,根据GenBank基因库上发表的各种属ffh基因序列,从保守区设计1对聚合酶链反应(PCR) 引物,进行PCR.结果在以变形链球菌和口腔链球菌基因组为模板的PCR中,所获得的特异性片段与预期结果一致.结论口腔链球菌中存在耐酸相关ffh基因,且口腔链球菌和变形链球菌耐酸相关基因ffh同源性高.
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口腔链球菌对伴放线嗜血菌生长影响的体外实验
目的:研究变异链球蒲、血链球菌、远缘链球菌、唾液链球菌对伴放线嗜血菌生长的影响.方法:制备伴放线嗜血菌BHI琼脂扳,将4种口腔链球菌菌悬液滴注于其上,兼性厌氧培养48 h,观察有无抑菌现象.分别将4种口腔链球菌与伴放线嗜血菌等体积等浓度混合制成双菌种悬液在液体BHI中培养,每隔4 h取浮游菌悬液梯度稀释,接种于BHI琼脂板上培养48 h,计数伴放线嗜血菌占菌落总数的百分比;扫描电镜观察双菌种生物膜生长情况.结果:琼脂扩散实验显示,变异链球菌、血链球菌、远缘链球菌周围出现抑菌圈,唾液链球菌周围未出现抑菌圈.伴放线嗜血菌所占双菌种混合细菌的比例随时间延长呈下降趋势(p＜0.05).生物膜观察显示,单菌种伴放线嗜血菌形成生物膜的时间较口腔链球菌时间长;双菌种混合培养时伴放线嗜血菌的量随时间推移而减少.结论:4中种口腔链球菌抑制伴放线嗜血菌生长.
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口腔链球菌摄取生物素与口内白色念珠菌生长的关系
为了探讨口腔细菌生态平衡机制,本文检测了4株口腔链球菌(S. salivarius, S. sanguis, S.mutans和S. mitior)和白色念珠菌生长对生物素的依赖性.结果显示白色念珠菌和口腔链球菌的生长绝对依赖生物素,前者大半数生长需要生物素约10 pmol/L,其大生长率所需生物素约为100 pmol/L;而后者大半数生长需生物素为5～25 pmol/L.正常人血清和唾液中生物素含量约为212～294 pmol/L.生物素饥饿状态下的白色念珠菌和口腔链球菌,以及唾液离心沉淀物(绝大多数为细菌)摄取生物素具温度依赖性,而代谢抑制剂(叠氮化合物、氰化物和醋酸碘)和某些抗生素(杆菌肽、短杆菌肽、万古霉素和二性霉素)具选择性抑制效应,提示生物素的摄取和跨膜转运是一依赖能量的主动过程.用唾液沉淀物和口腔链球菌吸收培养基中的生物素或与白色念珠菌共培养,显著抑制白色念珠菌的生长.这些实验提供证据显示口腔优势菌可能通过竞争生物素等营养成份,抑制白色念珠菌生长,以维持口腔微生物之生态平衡.进一步实验显示处于饥饿状态的白色念珠菌摄取生物素具可饱和性和特异性.从饱和曲线算出主动摄取生物素的半数大初速率(1/2 Vmax)所需生物浓度,即Km值为(0.79±0.11) μmol/L(平均数±标准差,n=8);叠氮钠(5 mmol/L)处理后,其Km值增到(2.39±0.64) μmol/L(平均数±标准差,n=3).生物素之结构同源分子,如脱硫生物素、生物胞素、甲基酯生物素和对硝基苯酯生物素等竞争性抑制其主动摄取生物素,但是2-亚氨基生物素却完全无抑制作用.在生物素摄取充足的白色念珠菌(在含20 nmol/L生物素培养基中生长),生物素主要通过简单的弥散方式进入菌体内.由于血清中的生物素含量在pmol/L到几个nmol/L之间,白色念珠菌在体内可能主要通过主动摄取生物素机制满足其营养代谢需求.这些实验研究结果可能为发展抗白色念珠菌感染新举措提供某种理论基础.
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口腔链球菌的耐酸机制
在口腔天然菌群中,链球菌占的比例大,包括血链球菌、轻链球菌、唾液链球菌和变形链球菌(以下简称变链菌)等.口腔链球菌系产酸菌,能很快发酵糖产酸,导致环境pH下降.因此,链球菌在低pH环境中生长及继续代谢碳水化合物产酸是学者们面对的一大问题.本文对各种链球菌的耐酸机制进行综述.
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口腔链球菌右旋糖酐酶分子结构和功能的研究进展
右旋糖酐酶是一种葡聚糖酶,主要降解α-1,6葡聚糖,能够水解水溶性多糖,广泛存在于自然界中.很多细菌包括口腔链球菌在内都能够合成右旋糖酐酶.口腔链球菌合成的右旋糖酐酶与胞外多糖的修饰以及细菌的黏附有关.本文主要对近年来口腔链球菌右旋糖酐酶的分子结构及其功能的研究进行综述.
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密度感应在口腔链球菌感染中的作用机制
口腔链球菌之间可以通过密度感应进行交流,分泌和感应特定的信号分子,从而感应周围环境群体细菌的密度,同时激活相关基因的表达,以协调菌群生物学行为.密度感应与口腔链球菌的生存和致病密切相关,其可能成为控制链球菌致病的有效途径.
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口腔链球菌密度感应信号系统comE基因及luxS基因的检测分析
目的 检测口腔链球菌密度感应系统中的2个重要基因comE以及luxS.方法 选取口腔链球菌临床分离株NH521为研究对象,提取基因组DNA,通过聚合酶链式反应进行电泳鉴定和DNA测序,并与GenBank数据库中相关序列进行比较分析.结果 电泳鉴定表明口腔链球菌NH521存在comE和LuxS基因.所测序列与GenBank相关序列比较分析表明:luxS、comE基因在口腔链球菌种内不同株系间的DNA序列一致度分别为95.0%和99.6%;对比口腔链球菌与变异链球菌,luxS和comE基因的DNA序列一致度分别为74.1%和12.7%.结论 口腔链球菌NH521中存在comE和luxS基因序列,并且luxS基因在种内不同株系间比comE基因积累了更多变异,而comE基因在不同链球菌物种间却更加分化.
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口腔链球菌丙酮酸氧化酶基因调节区的DNA序列分析
目的了解口腔链球菌丙酮酸氧化酶基因调节区的分子结构.方法将从口腔链球菌丙酮酸氧化酶基因(Sopox) 的上游区序列体外扩增得到的,并经证明含有启动子活性的1.30 kb片段和PBK-CMV质粒DNA用HindⅢ单酶切产物连接,转化E.coli JM109,筛选阳性菌落,增菌后取质粒DNA,再经HindⅢ酶切鉴定.将阳性克隆进行DNA序列分析.结果重组克隆酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳显示,获得约为1.30 kb的条带,与预计片段大小相符证实其为阳性重组克隆.重组克隆测序获得Sopox基因上游序列共计1 350 bp.结论 Sopox基因调节区序列的获得为进一步阐明口腔链球菌产生过氧化氢的分子机理奠定基础.
