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口腔链球菌丙酮酸氧化酶基因缺陷型变异株的构建
目的:利用口腔链球菌丙酮酸氧化酶基因(sopox)的克隆序列,重组构建新的不能产生H2O2的口腔链球菌变异株.方法:口腔链球菌株ATCC10557经培养后用酚-氯仿法抽提细菌染色体基因组DNA,经PCR扩增sopox基因,用BamHI进行限制酶切;参照Chris方法进行电转化,挑选阳性菌落测定其上清液中H2O2的含量;将细菌传3～4代后再次重复上述检测.结果:转化子经筛选后得到1株阳性菌落,测定上清液中H2O2含量,第1次检测表明变异株产生H2O2的量仅有所下降(介于阳性对照ATCC 10557和阴性对照大肠杆菌JM109之间),经3～4次传代后变异株中上清液H2O2量已经明显低于阴性对照.结论:成功构建了口腔链球菌丙酮酸氧化酶基因缺陷型变异株.
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22-17 绿色组链球菌口咽分离菌的氟喹诺酮耐药性与作用靶的变异和活性外排泵有关
绿色组链球菌与2类重要的感染性疾病有关,即中性粒细胞减少症患者的菌血症和心内膜炎.革兰氏阳性菌,特别是肺炎链球菌和绿色组链球菌的氟喹诺酮耐药性与喹诺酮类药物的2个作用靶(拓扑异构酶Ⅳ和DNA促旋酶)的变异有关.绿色组链球菌临床分离株来自以下3组人员的口咽标本:(1)30名接受氟喹诺酮类药物(环丙沙星,氧氟沙星,培氟沙星)治疗平均12±3d的住院患者;(2)30名接受非氟喹诺酮类药物治疗至少5个月的同期住院患者;(3)30名未接受治疗未住院的健康对照.在包含3mg/L环丙沙星的琼脂平板上,从20分口咽标本中分离出20株环丙沙星MIC≥4mg/L的绿色组链球菌菌株,与相应的参考菌株相比,认为这些菌株对氟喹诺酮类药物敏感性减弱,其中绝大多数来自住院患者,而从30名健康对照的口炎标本中仅分离出3株氟喹诺酮耐药性绿色组链球菌.参考菌株有:缓症链球菌(S.mitis,SM)103335,口腔链球菌(S.oralis,SO)102922,血链球菌(S.sanguis,SS)55128.诺氟沙星、环丙沙星和司帕沙星对菌株SMB8～SMB14的MIC增至对参考菌株SM103335的2～32倍;对菌株SOB3～SOB14的MIC增至对参考菌株SO102922的2～128倍;对菌株SSB1、SSB2的MIC增至对参考菌株SS55128的8倍.在氟喹诺酮耐药性缓症链球菌中,仅有SMB13和SMB14在拓扑异构酶Ⅳ的C、E亚基(ParC,ParE)或DNA促旋酶A亚基(GyrA)的喹诺酮耐药决定区存在氨基酸取代,SMB13的ParC第79位Ser→Ile;SMB14的ParC无氨基酸取代,GyrA的第81位Ser→Phe,ParE的474位Glu→Lys,二者都与MIC的增加有关.对缓症链球菌,当存在利血平时,诺氟沙星或环丙沙星的MIC减至原来的1/4,认为存在外排泵表型.在参考菌株SMB103335和菌株SMB9、SMB13、SMB14中都观察到外排泵表型,该表型可以单独表达(SMB103335,SMB9),也可以与拓扑异构酶Ⅳ、DNA促旋酶的变异同时存在(SMB13,SMB14).对口腔链球菌,当存在利血平时,诺氟沙星或环丙沙星的MIC减至原来的1/4～1/16,认为存在外排泵表型.12株口腔链球菌中,10株(包括典型菌株SO102922)具有外排泵表型,特别是SOB5其喹诺酮耐药决定区无氨基酸取代发生,在存在利血平时,MIC可降至典型菌株SO102922的水平.ParC的氨基酸取代(79或83位)导致口腔链球菌对氟喹诺酮类药物敏感性降低(SOB6～SOB9,SOB14);ParC和GyrA(81或85位)同时发生氨基酸取代导致产生高水平氟喹诺酮(尤其是司帕沙星)耐药性.血链球菌SSB1在ParC的第83位Asp→Tyr;而SSB2在ParC和GyrA的喹诺酮耐药决定区无氨基酸取代,但存在显著的外排泵表型,在利血平存在谮时,环丙沙星和诺氟沙星的MIC分别降至原来的1/8和1/16.用来自表达高水平外排泵耐药性的缓症链球菌(SMB9)和口腔链球菌(SOB5)的DNA转化肺炎链球菌R6,结果肺炎链球菌R6转化子获得外排泵表型,在利血平存在时,肺炎链球菌R6转化子外排泵介导的耐药水平可降至野生菌株R6的水平,表明外排泵表型可以在种间传递.Guerin F, et al. Antimicrob Agents Chemother,2000,44(8):2197(英文)
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血链球菌产生过氧化氢能力的差异
目的:初步研究血链球菌产生过氧化氢的能力,筛选过氧化氢高产菌株.方法:从牙周健康人群口腔中收集血链球菌,采用酚红-辣根过氧化物酶微量板法测定细菌产生过氧化氢的量,并测定细菌的蛋白含量以定量观察血链球菌产生过氧化氢的能力.结果:每微克菌蛋白的血链球菌Ⅱ型(又称为口腔链球菌,Streptococcus oralis, S. oralis)产生过氧化氢的量高于血链球菌Ⅰ型(Streptococcus sanguis, S. sanguis)(P<0.05);有氧培养时血链球菌比厌氧培养产生更多的过氧化氢(P<0.05);和国际标准株S. oralis ATCC10557相比,S. oralis临床分离株1～12 能稳定地产生较高的过氧化氢.结论:血链球菌在有氧和厌氧情况下都能产生过氧化氢,有氧时产生过氧化氢的能力更强;S. oralis产生过氧化氢的能力高于S. sanguis,同一种细菌的不同株之间产生过氧化氢的能力有很大差异.血链球菌产生过氧化氢的机制需进一步研究.
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口腔链球菌丙酮酸氧化酶调节基因的克隆和功能分析
目的:阐明体外扩增得到的口腔链球菌丙酮酸氧化酶基因的上游区序列是否即是调控序列,是否具有启动子活性.方法:将口腔链球菌丙酮酸氧化酶基因调节区PCR扩增产物经Hind Ⅲ酶切,克隆至载体PKK232-8,转化E.coli JM109,通过氯霉素抗性筛选阳性菌落,重新增菌后取质粒DNA,再经酶切鉴定.将重组子点种于不同浓度的氯霉素平板上,37℃培养18 h,观察菌落生长情况,测定重组质粒转化子对氯霉素的抗性水平.结果:筛选得到1个阳性菌落,重组质粒DNA的酶切产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳,表明获得片段的Mr约为1.3 kb,与预计大小相符,证实其为阳性重组克隆.测定重组质粒转化子对氯霉素的抗性水平显示其抗性达1 020 μg/mL.结论:本研究已成功克隆口腔链球菌丙酮酸氧化酶调节基因.
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口腔链球菌的新分类
链球菌是口腔中常见的细菌,在口腔正常菌群中所占的比例大,从口腔中所有部位都可分离得到.在牙菌斑和龈沟的细菌中,链球菌约占30%.舌背和唾液中近一半的细菌是链球菌.近年来对口腔链球菌的研究日益广泛,对其认识也不断地深入,目前口腔链球菌已包括唾液链球菌群、咽颊炎链球菌群、变形链球菌群、轻型链球菌群、牛链球菌群、化脓性链球菌群以及5个尚未分群的菌种.本文就口腔链球菌的新分类以及小生境主要在口腔的链球菌作一简要的综述.
