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三种丙酮酸氧化酶法试剂盒测定ALT比较
丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase,ALT,俗称谷丙转氨酶GPT)测定是常见的肝功能试验之一,对肝炎防治、疾病普查及供血者筛查来说都是必不可少的检测项目,也是临床开展为普及的检测项目.丙酮酸氧化酶法是近年来出现的一种新的检测ALT的方法,一个小时即可检测300份标本,大幅度提高了ALT检测的工作效率.目前国内大多采用Trinder显色系统,还有四甲基联苯胺(TMB)显色系统.本研究对采用这两种显色系统的丙酮酸氧化酶法的三种ALT试剂盒进行临床对比,比较三种试剂盒灵敏度、特异性、均值和符合率,现报告如下:
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丙氨酸氨基转移酶干化学检测方法的建立及试纸条的制备
目的 建立一种以丙酮酸氧化酶法为反应原理的丙氨酸氨基转移酶( Alanine aminotransferase,ALT)干化学检测方法,并制备试纸条.方法 试纸条由扩散层、底物层和显色层组成,包被有反应试剂,用反射式光度计测定ALT活性.对制备的试纸条进行各项验证.结果 试纸条测定罗氏低、高值质控品的批内变异系数分别为7.4％和4.9％;线性范围为10～1000U/L;试纸条测定肝素锂抗凝全血及其血浆的结果差异无统计学意义(P＞0.05);标本中胆红素≤257 mol/L,抗坏血酸≤50 mg/L,丙酮酸≤0.5 mmol/L时,ALT测定结果不受影响;建立的干化学法与国际临床化学联合会(IFCC)推荐的方法相关性良好(r＝0.988 9);试纸条的95％置信区间参考范围为0～40U/L.结论 建立的于化学法反应迅速,结果准确,操作简便,适用于ALT的即时检验.
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丙氨酸氨基转移酶快速测定法
目的建立双波长微板法快速检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)的方法.方法采用酶标仪及两种ALT检测试剂,检测无偿献血者的ALT含量,并与赖氏法进行比较.结果快速法测定的阳性率高于赖氏法,且可消除轻度脂血的影响.结论双波长微板法快速测定ALT可用于无偿献血的初筛检验中,可大大减少初复检ALT阳性而造成的浪费.
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氧化酶法筛查献血者ALT的应用评价
目的:评价丙酮酸氧化酶法筛查献血者ALT的准确性和价值. 方法:采用低、中、高值质控血清、脂血、溶血标本和300份无偿献血者血标本对该法的线性、重复性等进行检测.结果:测定值与理论值相关系数r=0.0998,高、中、低值批间CV值分别为5.1%、4.7%、4.9%;批内CV值分别为4.0%、3.5%、3.8%.脂血、溶血的干扰很小.结论:微板丙酮酸氧化酶法测定ALT操作简答,结果准确,影响因素少,适合血站筛查使用.
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西双版纳州健康人群血清丙氨酸氨基转移酶参考区间调查
目的 建立西双版纳州健康人群血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)丙酮酸氧化酶法参考区间.方法 对3 167名健康者血清ALT活性在不同性别、不同年龄组间的分布进行统计分析.结果 ALT活性男性明显高于女性(P<0.001).ALT参考区间上限:男性为42 U/L ,女性为37 U/L.男性血清ALT活性在30～59岁组较高(其中40～49岁组高),＜20岁组低;ALT参考区间上限:<20岁为34 U/L,20～29岁为46 U/L,30～59岁为47 U/L,≥60 岁为39 U/L.女性≥40岁者血清ALT活性较高(其中50～59岁组高),≤29岁者较低;ALT参考区间上限:≤29岁为34 U/L,30～39岁为35 U/L,≥40岁为40 U/L.结论 ALT活性在不同性别、不同年龄组间有明显差异,各实验室应按不同性别、不同年龄建立本地区、本实验室血清ALT参考区间.
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丙氨酸依赖型转氨酶高通量快速检测方法的建立
本研究以来源自Vibrio fluvialis JS17的丙氨酸依赖型转氨酶VfTA为研究对象,偶联丙酮酸氧化酶和辣根过氧化物酶,建立了一种基于反应液颜色变化的转氨酶活性测定新方法,反应条件优化后,考察了VfTA活力单位数与反应液400 nm处吸收度的线性关系,并将此法用于商业化转氨酶ATA117活力的研究.结果显示:该法对转氨酶VfTA的活力检测限可达0.45 U/mL,对ATA117的活力检测限可达0.5 U/mL,并且可根据反应液颜色深浅初步判断酶活力情况.
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丙酮酸氧化酶速率法在献血者ALT筛查中的应用
目的 评价丙酮酸氧化酶速率法应用于献血者ALT筛查的意义.方法 利用丙酮酸氧化酶氧化丙酮酸生成过氧化氢,过氧化氢与2,4,6三溴-3-羟基苯甲酸和4-氨基比林在过氧化物酶作用下生成红色醌类化合物的原理.结果 该方法线性范围达300 U/L,与紫外酶偶联速率法比较,相关系数r=0.989,Y=1.075X+1.031,n=80.结论 该方法具有线性范围大、操作简便、快速、重复性好、抗干扰能力强等优点,适合血站大批量标本的检测.
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丙酮酸氧化酶速率法在献血员ALT筛查中的应用评价
目的:丙酮酸氧化酶速率法应用于献血员ALT筛查.方法:利用氧化酶丙酮酸生成过氧化氢,过氧化氢与2,4,6三溴-3-羟基笨甲酸和4-氨基比林在过氧化物酶作用下生成红色醌类化合物的原理.结果:该方法线性范围大,灵敏度高,结果准确,重复性好,抗干扰能力强等优点,适合血站大批量标本的检测.
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血清唾液酸丙酮酸氧化酶测定新法的研究及应用
目的 探讨建立一种血清唾液酸测定的新方法以及临床应用.方法 应用N-乙酰神经氨酸酶、丙酮酸氧化酶、抗坏血酸氧化酶、N-乙酰神经氨酸醛缩酶、过氧化物酶与色原系统3-甲基-N-乙基(β-羟乙基)苯胺、4-氨基安替比林进行血清唾液酸浓度的酶法测定.结果 磷酸盐缓冲液适浓度为50 mmol/L、pH 7.2,大吸收峰值为510 nm,线性范围为0~4 500 mg/L,显色稳定.精密度为批内(n=30)变异系数(CV)=1.90%~3.3%,批间(n=30)CV=1.98%~3.5%,回收率为95.2%~105.1%,平均回收率为99.6%.与酶偶联速率法比较,相关系数(r)=0.996,回归方程Y=1.028X+0.40,两法高度相关,正常参考值范围50~90 mg/L.结论 该方法具有高度的特异性和准确性,操作简便、灵敏快速、标本用量少、结果稳定,适用于全自动、半自动生化分析仪,更适用于中小型医院,有较高的推广使用价值.
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肺炎链球菌SpxB蛋白的细胞表达定位、保守性分析及其生物学功能初探
目的 鉴定肺炎链球菌中spxB基因编码蛋白的丙酮酸氧化酶活性、细胞表达定位和保守性表达,并初步研究该基因对细菌毒力影响的部分机制.方法 利用PCR方法扩增肺炎链球菌D39菌株的spxB基因全长序列,并将其整合至表达载体pET-28a(+),经测序鉴定后,将重组质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达含有His标签的rSpxB蛋白,经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,使用SDS-PAGE鉴定蛋白纯度,采用一种商品丙酮酸氧化酶活性质控方法鉴定其酶活性.以rSpxB蛋白免疫昆明小鼠获得其多克隆抗体.采用ELISA检测多克隆抗体效价,采用Western blot鉴定抗体的特异性和蛋白的保守性表达.采用流式细胞术鉴定spxB的细胞表达定位.构建spxB缺陷菌,通过与流感嗜血杆菌进行共同培养初步探索其毒力机制.结果 实现了具有丙酮酸氧化酶活性SpxB蛋白的可溶性表达,该蛋白免疫小鼠后获得高效价特异的抗SpxB蛋白抗血清,Western blot鉴定显示SpxB蛋白在1、2、4、6B、14、19F和23F等血清型肺炎链球菌均有表达,流式细胞术检测显示SpxB蛋白的荧光信号较阴性对照有右移,但较阳性对照的荧光信号弱很多.野生菌株D39产生的过氧化氢显著高于spxB缺陷菌,D39菌株对流感嗜血杆菌的生长抑制作用显著强于spxB缺陷菌.结论 肺炎链球菌spxB基因编码的蛋白具有丙酮酸氧化酶活性,在肺炎链球菌中有保守表达,且主要表达于细胞内.该蛋白有助于肺炎链球菌与流感嗜血杆菌共同生长时的优势生长.
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微板丙酮酸氧化酶法在健康人群中筛查ALT应用分析
目的 探讨微板丙酮酸氧化酶法在健康人群中筛查丙氨酸转移酶(ALT)的作用.方法 用丙氨酸氧化酶法和IFCC速率法检测9 767份健康体检标本,比较两种方法的敏感性和精密度.结果 徽板丙酮酸氧化酶法的初筛阳性率为5.80％,用酶标仪比色测定复检阳性率为1.31％；而IFCC速率法阳性率为1.29％.两法测定ALT差异无统计学意义(P＞0.05).结论 微板丙酮酸氧化酶法具有线性范围大、灵敏、操作简便、快速、结果准确、重复性好、抗干扰能力强等优点,适合各级疾病预防控制中心对大批量健康人群的筛检.
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口腔链球菌丙酮酸氧化酶基因调节区的DNA序列分析
目的了解口腔链球菌丙酮酸氧化酶基因调节区的分子结构.方法将从口腔链球菌丙酮酸氧化酶基因(Sopox) 的上游区序列体外扩增得到的,并经证明含有启动子活性的1.30 kb片段和PBK-CMV质粒DNA用HindⅢ单酶切产物连接,转化E.coli JM109,筛选阳性菌落,增菌后取质粒DNA,再经HindⅢ酶切鉴定.将阳性克隆进行DNA序列分析.结果重组克隆酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳显示,获得约为1.30 kb的条带,与预计片段大小相符证实其为阳性重组克隆.重组克隆测序获得Sopox基因上游序列共计1 350 bp.结论 Sopox基因调节区序列的获得为进一步阐明口腔链球菌产生过氧化氢的分子机理奠定基础.
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口腔链球菌丙酮酸氧化酶基因缺陷型变异株的构建
目的:利用口腔链球菌丙酮酸氧化酶基因(sopox)的克隆序列,重组构建新的不能产生H2O2的口腔链球菌变异株.方法:口腔链球菌株ATCC10557经培养后用酚-氯仿法抽提细菌染色体基因组DNA,经PCR扩增sopox基因,用BamHI进行限制酶切;参照Chris方法进行电转化,挑选阳性菌落测定其上清液中H2O2的含量;将细菌传3～4代后再次重复上述检测.结果:转化子经筛选后得到1株阳性菌落,测定上清液中H2O2含量,第1次检测表明变异株产生H2O2的量仅有所下降(介于阳性对照ATCC 10557和阴性对照大肠杆菌JM109之间),经3～4次传代后变异株中上清液H2O2量已经明显低于阴性对照.结论:成功构建了口腔链球菌丙酮酸氧化酶基因缺陷型变异株.
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口腔链球菌丙酮酸氧化酶基因的克隆和序列分析
目的阐明血链球菌产生过氧化氢及其调节的分子机理.方法根据已知的肺炎链球菌丙酮酸氧化酶基因(spxB)序列设计PCR引物,扩增血链球菌ATCC10557的丙酮酸氧化酶基因,以pUC18及M13mp18、M13mp19为载体进行克隆和亚克隆,并进行序列分析.结果成功地从血链球菌ATCC10557扩增出丙酮酸氧化酶基因,获得该基因的全部序列(1788bp), 具有完整的开放读框,能编码591个氨基酸的多肽.结论血链球菌丙酮酸氧化酶基因的克隆和序列分析,为进一步研究调节血链球菌产生过氧化氢的分子机理打下了基础.
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口腔链球菌丙酮酸氧化酶调节基因的克隆和功能分析
目的:阐明体外扩增得到的口腔链球菌丙酮酸氧化酶基因的上游区序列是否即是调控序列,是否具有启动子活性.方法:将口腔链球菌丙酮酸氧化酶基因调节区PCR扩增产物经Hind Ⅲ酶切,克隆至载体PKK232-8,转化E.coli JM109,通过氯霉素抗性筛选阳性菌落,重新增菌后取质粒DNA,再经酶切鉴定.将重组子点种于不同浓度的氯霉素平板上,37℃培养18 h,观察菌落生长情况,测定重组质粒转化子对氯霉素的抗性水平.结果:筛选得到1个阳性菌落,重组质粒DNA的酶切产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳,表明获得片段的Mr约为1.3 kb,与预计大小相符,证实其为阳性重组克隆.测定重组质粒转化子对氯霉素的抗性水平显示其抗性达1 020 μg/mL.结论:本研究已成功克隆口腔链球菌丙酮酸氧化酶调节基因.
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丙酮酸氧化酶偶联法测定血清丙氨酸氨基转移酶的效果评价
目的 探讨丙酮酸氧化酶法联合偶联法在测定血清丙氮酸氨基转移酶中的作用.方法 丙酮酸氧化酶法原理:利用丙酮酸氧化酶氧化丙酮酸生成过氧化氢,过氧化氢与2,4,6三溴一3一羟基苯甲酸和4一氮基比林在过氧化物酶作用下生成红色醌类化合物的原理.结果 丙酮酸氧化酶法联合紫外酶偶联速率法线性范围达200U/I,与单纯紫外酶偶联速率法比较,相关系数r=0.989,y=1.075x+1.031,n=80.结论 丙酮酸氧化酶法联合偶联法在测定血清丙氨酸氨基转移酶具有线性范围大、灵敏、操作简便、快速、结果准确、重复性好、抗干扰能力强等优点,适合血站大批量标本的检测.
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测定计算填充法研制肌苷口服胶囊
肌苷参与体内能量代谢和蛋白质的合成,活化丙酮酸氧化酶,并能使细胞在缺氧状态下继续进行代谢.临床用于治疗白细胞或血小板减少症,各种急慢性肝脏疾病,肺源性心脏病以及心脏病,中心性视网膜炎,视神经萎缩等多种疾病.
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氧化酶法筛查献血者ALT的应用评价
目的:评价丙酮酸氧化酶法筛查献血者ALT的准确性和价值.方法:采用低、中、高值质控血清、脂血、溶血标本和300份无偿献血者血标本对该法的线性、重复性等进行检测.结果:测定值与理论值相关系数r=0998,高、中、低值批间CV值分别为51%、47%、49%;批内CV值分别为40%、35%、38%.脂血、溶血的干扰很小.结论:微板丙酮酸氧化酶法测定ALT操作简单,结果准确,影响因素少,适合血站筛查使用.
