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细胞表达定位文献资料
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肺炎链球菌SpxB蛋白的细胞表达定位、保守性分析及其生物学功能初探
目的 鉴定肺炎链球菌中spxB基因编码蛋白的丙酮酸氧化酶活性、细胞表达定位和保守性表达,并初步研究该基因对细菌毒力影响的部分机制.方法 利用PCR方法扩增肺炎链球菌D39菌株的spxB基因全长序列,并将其整合至表达载体pET-28a(+),经测序鉴定后,将重组质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达含有His标签的rSpxB蛋白,经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,使用SDS-PAGE鉴定蛋白纯度,采用一种商品丙酮酸氧化酶活性质控方法鉴定其酶活性.以rSpxB蛋白免疫昆明小鼠获得其多克隆抗体.采用ELISA检测多克隆抗体效价,采用Western blot鉴定抗体的特异性和蛋白的保守性表达.采用流式细胞术鉴定spxB的细胞表达定位.构建spxB缺陷菌,通过与流感嗜血杆菌进行共同培养初步探索其毒力机制.结果 实现了具有丙酮酸氧化酶活性SpxB蛋白的可溶性表达,该蛋白免疫小鼠后获得高效价特异的抗SpxB蛋白抗血清,Western blot鉴定显示SpxB蛋白在1、2、4、6B、14、19F和23F等血清型肺炎链球菌均有表达,流式细胞术检测显示SpxB蛋白的荧光信号较阴性对照有右移,但较阳性对照的荧光信号弱很多.野生菌株D39产生的过氧化氢显著高于spxB缺陷菌,D39菌株对流感嗜血杆菌的生长抑制作用显著强于spxB缺陷菌.结论 肺炎链球菌spxB基因编码的蛋白具有丙酮酸氧化酶活性,在肺炎链球菌中有保守表达,且主要表达于细胞内.该蛋白有助于肺炎链球菌与流感嗜血杆菌共同生长时的优势生长.
