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金黄色葡萄球菌中外排泵分子介导的消毒剂耐药机制
革兰阳性细菌金黄色葡萄球菌是重要的病原菌之一,可引起不同程度的感染,甚至威胁生命.除了它的潜在毒力,金黄色葡萄球菌也对各种抗菌物质表现出明显耐药性,而且耐药机制各异.尤其值得关注的是,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)对几乎所有的β-内酰胺类抗生素耐药,已引起多起医院感染暴发,而且也在社区中发现越来越多的MRSA菌株,这些菌株可能引起严重的、致命的感染[1].
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弯曲菌耐药机制研究进展
弯曲菌是全球范围内引发人类急性胃肠炎的主要食源性致病菌之一.虽然人类感染弯曲菌后死亡率较低,但可能导致严重的并发症如格林-巴利综合征、肠易激综合征等.氟喹诺酮类、大环内酯类等抗生素是临床治疗感染性胃肠炎的经验用药,但弯曲菌多重耐药性的出现和耐药程度的加剧给临床用药带来了严峻的挑战.本文结合国内外新的耐药文献,选择临床治疗弯曲菌感染常用的五类抗生素,综述了弯曲菌对其产生的耐药作用机制和传播规律,以期为临床医疗和畜牧养殖业提供合理的用药方案,并为新型抗生素的药物研发提供理论依据.
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VVC患者临床分离白念珠菌Cap1、Mrr1和MDR1在唑类药物交叉耐药中的作用
目的 探讨白念珠菌锌簇转录因子Cap1、Mrr1基因突变/高表达及外排泵基因MDR1的mRNA表达水平在唑类抗真菌药物氟康唑(FCA)、伊曲康唑(ITR)、伏立康唑(VRC)交叉耐药中的作用.方法 收集山西医科大学第二医院皮肤性病科门诊疑似外阴阴道念珠菌病(VVC)患者阴道分泌物标本,进行真菌直接镜检、培养、分离鉴定和体外药物敏感性试验,获得试验用白念珠菌耐药和敏感菌株共68株.采用PCR方法扩增68株白念珠菌临床分离菌株Cap1、Mrr1基因,并进行双向测序,应用Blast软件,将测序结果与GenBank中已发表的序列进行比对,分析基因突变情况,实时荧光定量PCR检测锌簇转录因子Cap1、Mrr1和外排泵基因MDR1的mRNA表达水平.结果 Cap1测序中1株ITR、VRC交叉耐药菌株出现P311S错义突变.Mrr1测序中1株FCA、ITR、VRC交叉耐药菌株出现5个错义突变(T917M,T923I,E1020Q,F1032L,S1037L);FCA、ITR、VRC交叉耐药菌株组中Cap1/Mrr1/MDR1的mRNA表达量分别高于敏感菌株组;CA、ITR、VRC交叉耐药菌株组Cap1和MDR1(r=0.173,P=0.571), Mrr1和MDR1(r=-0.091,P=0.766),Cap1和Mrr1基因(r=0.025,P=0.936)的mRNA表达量不相关(均P>0.05).结论 Cap1和Mrr1的突变可能和唑类药物交叉耐药有关.
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鲍曼不动杆菌耐药相关外排泵系统研究进展
鲍曼不动杆菌的外排泵从来源上可分为:染色体编码的外排泵系统和遗传元件携带的获得性外排泵系统,是固有和获得性耐药的重要原因.外排泵的外排底物包括多种类的抗菌药物,高表达的外排泵可以主动泵出菌体内的抗菌药物,从而产生耐药；外排泵也可以借助遗传元件作为载体,在不同菌株甚至不同菌种间水平传播,使鲍曼不动杆菌的耐药性不断增强并快速播散,从而导致多重耐药鲍曼不动杆菌日益增多.
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嗜麦芽窄食单胞菌临床株的多重耐药外排泵的研究
目的研究嗜麦芽窄食单胞菌临床株外排泵SmeDEF的表达与耐药的关系及其表达调控. 方法琼脂稀释法检测嗜麦芽窄食单胞菌对抗生素敏感性并检测泵抑制剂的作用,提取临床菌的RNA进行smeD的RT-PCR扩增.提取DNA进行smeT片段的PCR扩增,扩增产物进行序列分析. 结果随机选取的6株嗜麦芽窄食单胞菌均有扩增产物.SmeT的N端氨基酸序列相当保守,smeD-smeT间区测序发现耐药且泵抑制阳性株基因序列与敏感株明显不同.推测与耐药有关的突变出现在smeT的-82～-165区间. 结论嗜麦芽窄食单胞菌临床株SmeDEF外排泵的表达强弱与其耐药性有关.smeDEF基因的表达可能与调控基因间区的变化有关.
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siHybrids技术沉默铜绿假单胞菌外排泵 mexB基因体外效应的初步研究
目的 初步研究siHybrids技术对铜绿假单胞菌野生菌PAO1外排泵mexB基因体外沉默效应。方法 针对铜绿假单胞菌野生株PAO1外排泵mexB基因设计并合成3条特异性siHybrids分子和1条阴性对照siHybrids分子。在分子浓度为50 nmol/L下，分别以合成的siHybrids分子干扰铜绿假单胞菌野生菌PAO1，并设实验组为铜绿假单胞菌野生菌PAO1空白对照组，阴性对照组scamble(sc)-001，干预组siHybrids( si) -001、siHybrids( si) -002及siHybrids( si) -003，分别在干预12h及24h后采用real-time PCR法检测各实验组中靶基因mexB基因mRNA的表达水平。进一步采用Mueller-Hinton倍比稀释法检测50 nmol/L浓度下，siHy brids分子干预铜绿假单胞菌野生菌PAO1前后氯霉素(CP)、红霉素(EM)、左氧氟沙星(L-OrLX)、头孢他啶(CAZ)、美洛培南(MER)的小抑菌浓度(MIC)值。结果 不同siHybrids分子干预PAO1 12 h后，mexB基因mRNA表达量无明显差异性；但干预24 h后，mexB基因mRNA表达量：干预组（si-001，si-002，si-003）比空白对照组、阴性对照组（sc-001）有明显下降。对比干预12h、24h后mexB基因mRNA表达量，可以发现空白对照组、阴性对照组（sc-001）mRNA的表达量成上升趋势，而干预组（si-001，si-002，si-003）mexB基因mRNA表达量均呈下降趋势。siHybrids分子在干预铜绿假单胞菌野生菌24h前后的氯霉素(CP)、红霉素(EM)、左氧氟沙星( L-OFLX)、头孢他啶(CAZ)、美洛培南(MER) MIC无明显差异性。结论 在mRNA表达水平上，siHybrids分子能体外干预铜绿假单胞菌PAO1 mexB基因mRNA表达，此种沉默作用呈现时间依赖性，且在24h能有效地发挥干预作用。
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湖南省铜绿假单胞菌四种外排泵在多重耐药菌株中表达的分布及作用
目的 探讨湖南省多重耐药(multi-drug resistance,MDR)铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa,Pa)中4种外排泵表达的分布和作用,以及相关调控基因的突变情况.方法 收集2008年湖南省临床首次分离非重复多重耐药Pa株40株,以外排泵抑制剂苯丙氨酸-精氨酸-β萘酰胺及4种药敏纸片进行外排泵表型初步筛选,PCR扩增膜融合蛋白基因及相关外排泵调控基因并测序;以18组非多重耐药菌株为对照研究分析Pa外排泵基因表达在多重耐药中的作用.结果 表型筛选MDR组菌株MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-oprN、MexXY-OprM阳性率分别为45.0%(18/40)、30.0%(12/40)、42.5%(17/40)、12.5%(5/40);RT-PCR显示mexA、mexC、mexE和mexX表达阳性率分别为100%(58/58)、22.5%(9/40),45.0%(18/40)和22.5%(9/40).Real-time PCR半定量分析菌株超表达mexA和mexX阳性率分别为55.0%(22/40)和22.5%(9/40).非多重耐药组中,mexA与mexX real-time PCR超表达阳性率均为0(0/18).mexC和mexE RT-PCR表达阳性率分别为11.1%(2/18)、38.9%(7/18).两组相比,mexA与mexX超表达差异有统计学意义(P<0.001,P=0.045).随机挑选超表达mexA菌株Pa20出现mexR的164GTG→GAG、126Val→Gh替代;超表达mexX菌株Pa34出现mexZ的164GCG→GAG、55Ala→Glu.结论 湖南省多重耐药Pa株大多存在主动外排的耐药机制,其耐药与外排基因Mex-AB-OprM和MexXY-OprM超表达有关.主动外排泵MexAB-OprM和MexXY-OprM超表达大多存在其调控基因突变.
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鲍曼不动杆菌临床株多重药物外排泵AdeABC的研究
目的 研究鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)临床株外排泵AdeABC的表达与耐药的关系及表达调控.方法 微量肉汤稀释法检测鲍曼不动杆菌临床株对抗菌药物的敏感性及泵抑制剂作用,RT-PCR检测泵基因adeB的mRNA表达水平,PCR扩增泵调控基因adeRS并测序分析.结果 30株多重耐药的鲍曼不动杆菌临床株及5株敏感株均存在泵结构基因片段adeB和调控基因adeRS,随机选取15株多重耐药株中均检测到adeB的mRNA表达,而在5株敏感株中无表达.测定2株多重耐药株调控基因adeRS序列均出现基因突变,发生氨基酸替代及缺失.结论 鲍曼不动杆菌临床株外排泵AdeABC的表达可能与耐药性有关,在多重耐药株中存在着调控基因adeRS的基因序列变化.
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鲍曼不动杆菌临床株的外排泵研究
目的 探讨鲍曼不动杆菌临床株外排泵AdeABC、AdeIJK、AdeFGH、AbeM、AbeS、CraA、MdtL的表达与耐药的关系.方法 收集多重耐药鲍曼不动杆菌临床株32株和敏感株10株,PCR扩增泵基因；选取主要克隆型的21株多重耐药株和10株敏感株,实时荧光定量RT-PCR方法检测泵基因adeB、adeJ、adeG、abeM、abeS、craA、mdtL的mRNA相对表达水平,PCR扩增泵调控基因adeRS、adeL并测序分析.结果 32株多重耐药鲍曼不动杆菌临床株中携带泵结构基因片段adeB100％、adeJ 100％、adeG 100％、abeM 96.88％、abeS 100％、craA 100％、mdtL 93.75％,10株敏感株均存在7种泵结构基因片段；主要克隆型的21株多重耐药株和10株敏感株adeB、abeM、mdtL的mRNA相对表达水平的差异有统计学意义( P＜0.001,P=0.001,P=0.013),选取多重耐药株AbR3和AbR11检测外排泵AdeABC调控基因adeRS序列出现氨基酸替代及缺失,而外排泵AdeFGH调控基因adeL序列无基因突变.结论 鲍曼不动杆菌临床株外排泵AdeABC、AbeM、MdtL的表达可能与耐药性有关.
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体内外光滑假丝酵母菌氟康唑耐药机制的比较研究
目的 研究比较临床分离和体外诱导的耐氟康唑光滑假丝酵母菌的耐药机制.方法 选取临床分离的4对氟康唑敏感-耐药配对的光滑假丝酵母菌,其中4株敏感株在体外氟康唑的作用下均被诱导为耐药株.利用罗丹明6G试验比较敏感株与两种耐药株的外排泵作用,实时荧光定量RT-PCR检测外排相关基因CDR1、CDR2、SNQ2和ERG11的表达.同时,对PDR1基因进行PCR扩增和测序,对比分析临床耐药株和体外诱导耐药株的突变位点.结果 临床耐药株和体外诱导耐药株外排泵的功能均明显强于敏感株；两者CDR1表达均显著升高,而CDR2和SNQ2则无明显变化；ERG11在敏感与耐药菌株之间的表达水平也无显著差别；两种耐药株的PDR1均发现错义突变位点,其中P927S、L543P及S947L突变尚未被报道过.结论 光滑假丝酵母菌在体内外氟康唑作用下PDR1均产生突变,引起外排相关基因,尤其是CDR1的表达增加从而增强了外排泵的作用导致耐药.
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大肠埃希菌外排泵研究进展
随着抗生素的广泛应用,临床上产生一些多重耐药菌株.多重耐药菌株的产生使常规抗生素在临床细菌性感染治疗中失效.细菌主动外排是耐药菌株产生多重耐药的主要机制之一.
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铜绿假单胞菌药物外排泵研究进展
感染性疾病目前仍然是威胁全球人类健康的第二大杀手,发达国家的第三大杀手[1].欧美和中国的多项病原菌流行病学监测资料中,铜绿假单胞菌(p-seudomonas aeruginosa,PA)均高居榜首[2,3],尤其是获得性免疫缺陷综合征(AIDS)等严重免疫缺陷性患者,一旦感染PA往往是致命性的.此外,PA也足囊性纤维化患者重要的死亡原因[4].
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多重耐药鲍曼不动杆菌耐药性及AdeABC外排泵作用研究
目的 了解我院多重耐药鲍曼不动杆菌(MRAB)耐药性及AdeABC外排泵在耐药中的作用.方法 琼脂稀释法检测临床分离20株MRAB对10种抗菌药物的低抑菌浓度(MICs).PCR、RT-PCR分别检测adeB外排泵基因阳性率和表达水平.结果 20株MRAB,对阿米卡星、环丙沙星、哌拉西林、头孢哌酮MIC均较高,但对多黏菌素B均敏感.PCR扩增adeB基因均阳性,RT-PCR显示MRAB中adeB基因的表达量是敏感株的7.27～19.34倍.结论 AdeABC外排泵过表达是造成鲍曼不动杆菌多重耐药的一个重要原因.
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嗜麦芽窄食单胞菌两株临床菌株外排泵SmeDEF诱导表达的研究
近10年来嗜麦芽窄食单胞菌所致的感染不断上升,已成为医院感染的重要致病菌,其多重耐药可能与外排泵有关.SmeDEF泵外排包括氟喹诺酮类等多种抗生素.大肠埃希菌多药外排泵AcrAB表达,与耐药表型的诱导有关,是否嗜麦芽窄食单胞菌也有同样机制,待研究.
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主动外排泵外膜蛋白编码基因hefA在幽门螺杆菌多重耐药中的重要作用
目的: 研究幽门螺杆菌(H pylori)分离株的多重耐药机制.方法:用氯霉素对临床分离株H pylori和标准株H pylori进行体外诱导,琼脂稀释法测定诱导后菌株对甲硝唑、四环素、琥乙红霉素、环丙沙星和青霉素G的耐药性,从而筛选出多重耐药株;实时定量PCR检测多重耐药株和敏感株中编码主动外排泵外膜蛋白的结构基因hefA的mRNA水平.通过构建hefA基因敲除株,测定敲除前后菌株对10种抗生素的敏感性.PCR扩增20株H pylori临床分离株主动外排泵结构基因hefA和hefC.结果:经氯霉素诱导后,筛选出的耐药菌株均表现出相似的多重耐药性,6株多重耐药株hefA基因mRNA水平显著高于敏感株(5.8466±2.9370 vs 2.6356±1.7245,P=0.033);成功构建了HefA基因敲除株(△HpLZ1026),△HpLZ1026对4种抗生素的敏感性明显增加;所有20株临床分离株中均检测出hefA和hefC基因,未发现hefABC基因缺失株.结论:主动外排系统hefA基因高表达导致体外人工诱导H pylori多重耐药的产生;hefABC基因在H pylori中普遍存在,且在H pylori多药耐药机制中起重要作用.
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幽门螺杆菌外排泵的研究进展
随着抗生素的广泛应用及滥用,幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)耐药现象日益严重,并已出现了同时对甲硝唑、克拉霉素、阿莫西林耐药的多重耐药(multidrug resistance,MDR)株,导致H.pylori根除率下降,给临床治疗带来了极大的困难.细菌外排泵的存在是细菌对大多数抗生素耐药的重要机制,尤其在多重耐药中起重要作用.因此为解决H.pylori日益增高的耐药性问题,近年来,外排泵的作用机制及其抑制剂的研究备受关注,并有重要的研究发现,对耐药性的防治具有重要的意义.本文就H.pylori外排泵及其外排泵抑制剂的研究进展作一综述.
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外排泵ABC转运蛋白基因msbA和spab在幽门螺杆菌多重耐药中的重要作用
目的:探讨外排泵ABC转运蛋白基因msbA和spab在幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylon)多重耐药中的作用.方法:从临床上胃炎和消化性溃疡患者的胃黏膜标本分离H.pylori.采用琼脂二倍稀释法测定氨苄西林、头孢曲松、四环素、克拉霉素、氧氟沙星和呋喃唑酮对H.pylori的小抑菌浓度(MIC).应用氯霉素对敏感株和标准菌株进行体外诱导多重耐药.采用RT-PCR的方法分别测定敏感株和多重耐药株中msbA和spab基因的相对表达量.分别构建msbA和spab的基因敲除株,分别测定敲除前后菌株对9种抗生素的敏感性.结果:诱导出包括标准菌株NCTC11637在内的5株多重耐药株.多重耐药株中msbA和spab基因的相对表达量明显高于敏感株(1.8200±0.5310,1.8340±0.2726 vs 0.8420±0.0789,P=0.018,0.015).成功构建了msbA和spab基因敲除株(H.pylori MZ1006△msbA和H.pyloriMZ1006△spab),两株基因敲除株对4种抗生素的敏感性相对于野生株分别有明显的增加.在临床分离的20株H.pylori中均检测出msbA和spab基因,未发现基因缺失株.结论:ABC转运蛋白msbA和spab基因在H.pylori重耐药机制中起重要作用.
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耐药基因和药物外排泵在广泛耐药结核分枝杆菌中的作用初探
目的 初步探讨2种主要的耐药机制在广泛耐药(XDR)MTB临床分离株中的作用.方法 提取XDR-MTB临床分离株基因组DNA,采用PCR法扩增耐药相关基因,测序后分析其突变位点.根据XDR-MTB分离株KZN605的15个特有单核苷酸突变位点设计引物扩增后测序比对.检测药物外排泵抑制剂利血平、羰基氰化氯苯腙和盐酸维拉帕米对XDR-MTB分离株低抑菌浓度(MIC)值的影响.结果 10株XDR-MTB菌株在rpoB、katG和rpsL位点均检测到突变,9株分离株在gyrA位点检测到突变,2株在gyrB位点检测到突变,6株分离株在rrs位点检测到突变,未检测到tlyA位点突变;未检测到大部分KZN605株特异的单核苷酸突变位点;药物外排泵抑制剂利血平导致1株XDR-MTB分离株的氧氟沙星MIC值降至原MIC的1/16,其余MIC值均无明显变化.结论 耐药相关基因突变是XDR-MTB分离株耐药的主要机制,药物外排泵可能部分参与氟喹诺酮类药物的耐药机制.
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碳青霉烯酶:未来困扰我们的难题
在所有β内酰胺类抗生素中,碳青霉烯类具有广泛的抗菌活性,它对革兰阴性菌产生的超广谱β内酰胺酶(ESBL)、AmpC酶都很稳定;但随着碳青霉烯类的广泛使用,细菌也逐渐获得对此类药物的耐药性.铜绿假单胞菌由于外膜蛋白的D2孔的缺失而对亚胺培南耐药.非特异的多药外排泵的表达增强可以引起铜绿假单胞菌对美罗培南、头孢菌素、喹诺酮类、四环素等耐药.肠杆菌科细菌高产AmpC酶,同时外膜通透性降低,会造成碳青霉烯类耐药.麻烦的是,近来产生获得性碳青霉烯酶的铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肠杆菌科细菌的报道有所增加[1,2].由这些产酶株感染造成的暴发流行,使治疗陷入无药可用的境地,病死率很高.
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AcrAB-tolC外排泵及marA-soxS-rob调控系统对福氏志贺菌环丙沙星耐药性的影响
目的 探讨AcrAB-tolC外排泵及mar A-soxS-rob调控系统对福氏志贺菌环丙沙星耐药性的影响.方法 连续收集45株2009至2013年分离自天津地区多家三级甲等医院肠道门诊患者粪便样本的福氏志贺菌.采用改良Kirby-Bauer纸片扩散法对菌株进行药物敏感性试验.随机选择10株环丙沙星耐药株和10株环丙沙星敏感株,分析其靶位酶基因(gyrA和parC),质粒介导的喹诺酮耐药基因(PMQR),外排泵基因(acrA和acrB)及调控基因(marA、soxS和rob)的携带情况,并进行序列分析.通过泵抑制剂羰基氰氯苯腙(CCCP)抑制试验检验外排泵基因及调控基因对菌株低抑菌浓度(MIC)的影响,同时应用实时荧光定量PCR(RT-PCR)方法检测外排泵基因及调控基因的表达水平,并采用t检验比较这些基因在环丙沙星耐药株和敏感株中表达水平的差异.结果 10株环丙沙星耐药株均存在gyrA和parC突变,环丙沙星耐药株CR2同时携带qnrS1,环丙沙星耐药株CR5同时携带aac(6')-Ib-cr基因.10株环丙沙星敏感株均未检测到外排泵基因及调控基因突变;而10株环丙沙星耐药株中,除CR10外,其余菌株均检出soxRS突变.加入CCCP后,喹诺酮类药物对10株环丙沙星耐药株的MIC均下降至原值的1/4 ～ 1/8,而对10株环丙沙星敏感株的MIC无变化或仅下降至原值的1/2.与环丙沙星敏感株相比,环丙沙星耐药株acrA、acrB、marA和soxS基因的表达水平明显升高(P ＜0.05或P＜0.01).结论 外排泵机制可能在福氏志贺菌对环丙沙星耐药中发挥重要作用,mar A-soxS-rob调控系统发挥着调节泵基因表达的作用,且soxRS基因序列的改变可能是影响此调控系统的重要原因.
