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四川省结核分枝杆菌VNTR分型研究
目的 评价不同串联重复序列(VNTR)位点在四川省结核分枝杆菌中的基因多态性,以及不同VNTR位点组合在四川省结核分枝杆菌基因分型中的应用.方法 采用多位点数目可变串联重复序列分析技术(MLVA)对102株四川省结核分枝杆菌菌株的15个VNTR位点进行分析,基因多态性分析采用Hunter-Gaston指数,聚类分析采用BioNumerics软件.结果 15个VNTR位点的基因多态性存在较大的差异,位点Mtub21 (HGI 0.772)和MIRU26( HGI 0.764)的多态性较高,ETR-C(HGI 0.168)和MIRU23 (HGI 0.077)的多态性较差.ETR-B和ETR-C两个位点在对四川省北京基因型结核分枝杆菌进行分型时则不具有多态性.对不同的VNTR位点组合进行比较,随着VNTR位点的增加,VNTR分型方法的分辨能力也有所提高.10个VNTR位点组合的分辨指数与15位点组合的分辨指数相差不大.同一VNTR位点在不同地区北京基因型菌株中的分辨力也存在较大的差异.结论 不同VNTR位点在四川省结核分枝杆菌中具有不同的分辨力,并且同一VNTR位点在不同地区的北京家族菌株中的分辨力也不同.10个VNTR位点组合的基因分型方案可用于四川省结核分枝杆菌基因分型的一线方法.本研究的数据结果对挑选适合中国结核分枝杆菌基因分型的VNTR位点组合法具有重要的作用.
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利用串联重复序列研究炭疽芽胞杆菌的基因分型
目的 应用基因组中多位点串联重复序列遗传标记对不同地区88株炭疽芽胞杆菌进行基因分型.方法 炭疽芽胞杆菌染色体DNA基因组中存在着串联重复序列.在串联重复序列两侧设计引物,PCR扩增,琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳,凝胶影像分析软件对PCR扩增产物碱基含量进行测算,并与测序结果进行比较,计算出串联重复拷贝数,对拷贝数进行聚类分析.结果 (1)聚类分析发现,88株菌株可分为三大群,45个基因型,基因型与生态环境存在一定的关系.就某一地区炭疽暴发而言,其可变数目串联重复序列遗传标记具有相似性.(2)研究发现,A16R疫苗株作为中国的疫苗株具有代表性.结论 炭疽芽胞杆菌基因组中的串联重复序列具有遗传稳定性和特异性,可作为炭疽芽胞杆菌基因分型的指标,在炭疽暴发和生物恐怖事件中的病原体溯源上具有重要的意义.
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肠炎沙门菌可变数目串联重复序列位点用于多位点可变数目串联重复序列分型分析的评价
目的 评价不同肠炎沙门菌可变数目串联重复序列(VNTR)位点用于多位点可变数目串联重复序列(MLVA)分型的可行性.方法 选取已报道使用的肠炎沙门菌11个VNTR位点,对中国不同时间和地区分离的16株菌进行初步评价,选取具有单一扩增条带的位点进行104株肠炎沙门茵的MLVA分型分析.对这些菌株同时进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析,比较MLVA分型方法与PFGE分型方法对菌株分型能力的强弱.结果 初筛得到7个VNTR位点用于扩大菌株的分析,这些位点将104株菌分为16个MLVA型别,D值为0.7222,这些菌株同时被分为22个PFGE型别,D值为0.7974.对两种方法各自所分的大组包含的菌株进行比较,发现PFGE具有更强的分辨能力;从频数分布看,PFGE方法分型结果比较分散,MLVA分型较为集中.结论 用于国际肠炎沙门菌分型具有扩增多态性的VNTR位点在国内分离株中并不都具有多态性结果,在MLVA方法学建立中应选择更多的VNTR位点进行广泛的筛选才有利于国际实验室间的方法的统一.
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微卫星DNA标记技术及其在蚊虫生物学研究中的应用
遗传标记是指用来区分不同的个体或群体,能够稳定遗传的物质或性状,是研究生物遗传学、发育生物学及分类学的重要工具.遗传标记经历了不同的发展阶段,20世纪70年代以来,随着限制性内切酶的发现和DNA重组技术的创立,遗传标记的研究重点转向遗传信息的载体--DNA分子,出现了多种分子遗传标记.常用的DNA分子标记技术有:DNA限制性酶切长度多态性(RFLP);数量可变的串联重复序列(VNTR)(主要包括微卫星和小卫星)分析;DNA序列分析以及基于PCR的随机扩增DNA多态性(RAPD)、扩增片段长度多态性(AFLP)和单链构象多态性(SSCP)等分析技术.DNA分子遗传标记,特别是微卫星DNA与其他遗传标记相比,具有稳定性高、信息含量高、种群中分布广泛等优点,正日益受到人们的重视.
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河南省结核分枝杆菌临床株散在分布重复单位基因型分型法的应用
目的 建立结核分枝杆菌散在分布重复单位(MIRU)基因型分型法,探讨其在河南省临床株分型应用中的可行性.方法 采用简单数字表法随机抽取河南省2000年结核病流行病调查中保存的菌株149株,对其进行MIRU分型.结果 MIRU分型方法 可将这些菌株分为50种基因型.12个MIRU位点的多态性分析表明各位点有较大的区别,其中位点26显示了较高的多态性(h=0.69),位点31、39、40显示了中等程度的多态性(h值分别为0.36、0.30、0.32).结论 MIRU基因分型技术重复性好、快速、简便、经济,不需要昂贵的设备,是一种有效实用的结核分枝杆菌基因型分型方法 .
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微卫星稳定性的遗传调控
微卫星DNA(microsatellite DNA)是指广泛存在于真核生物基因组中的简单串联重复序列,以2～6个核苷酸为重复单位.微卫星代表基因组内不稳定的区域,比非重复DNA序列的突变频率高得多.微卫星不稳定性(microsatellite instability,MSI)是由于错配修复基因突变而引起的简单重复序列的改变,常表现为重复单位数量的增加或减少.这种不稳定性具重要意义:第一,不稳定性导致多态的等位基因,用于人和其它较高等真核生物的遗传作图研究.第二,基因内或基因附近简单重复序列长度的变化,能改变这些基因的表达或功能[1],在人类,许多遗传疾病反映出简单重复序列的扩增[2].第三,序列不稳定性的增加,可用以诊断某些具DNA错配修复缺陷的肿瘤.本文综述序列不稳定性的机制及序列稳定性的调控及其与人类疾病的联系.
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脑膜炎奈瑟菌基因组中可变数目串联重复序列与血清分群之间关系的研究
目的 研究脑膜炎奈瑟菌(Neisseria Meningitides,Nm)基因组中串联重复序列(Variable Number of Tandem Repeats Sequences,VNTRs)与血清分群(A和C群)之间的关系.方法 采用Nm血清抗体玻片凝集法对Nm菌株进行血清学鉴定;选择4对引物,应用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增Nm基因组中4个位点的VNTR 01～04,使用非加权配对算术平均法,应用统计学软件分析VNTRs拷贝(Copy)数与血清群之间的关系;以编码半乳糖转移酶基因中的VNTR 01位点之后一段核苷酸序列为特异引物,对Nm进行PCR扩增.结果 118株Nm菌株中,38株为A群,80株为C群,聚类分析可将118株菌分为5个组(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ).95.8%(113/118)的菌株位于Ⅰ、Ⅱ组内,Ⅰ组中97.3%(36/37)的菌株为A群,Ⅱ组中98.7%(75/76)的菌株为C群.用两对特异引物对118株菌株进行PCR扩增,以PCR产物有或无做为判断结果,结果与血清分群有96.6%(114/118)的一致性.结论 VNTRs拷贝数与血清群之间有较好的相关性,编码半乳糖转移酶基因中变异的核苷酸序列可以做为鉴别A、C群菌株的一种核酸标识.
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异基因造血干细胞移植后复发慢性髓系白血病患者嵌合体和融合基因的动态观察
本研究利用STR-PCR结合RT-PCR定量和定性检测异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后患者嵌合体和融合基因的表迭,分析其植入和微小残留病变情况,评价其对复发的预测价值.采用STR-PCR结合毛细管电泳进行定量检测嵌合体供体细胞嵌合率,采用RT-PCR方法检测融合基因转录本bcr/abl mRNA.结果表明:4例患者在移植后28天均为100%供者型嵌合,融合基因bet/abl mRNA均为阴性.但在以后的随访过程中发现4例患者在不同时间出现不稳定混合嵌舍(MC)状态(DC为0%-80.4%),融合基因bet/abl mRNA阳性;其中2例复发后一直处于混合嵌合状态,另外2例在临床干预治疗后又转变为完全嵌合状态,目前处于分子生物学缓解状态.上述4例复发患者均在出现临床症状前发生供体细胞嵌合率(DC)下降;融合基因表达阳性.结论:STR-PCR在敏感范围内,其结果与RT-PCR的结果符合率高,两种技术的结合是一种检测异基因造血干细胞移植后供体是否植入的有效手段,对判断疾病复发及GVHD均有预警作用,对实施临床干预治疗有重要指导价值.
关键词： 异基因造血干细胞移植 慢性髓系白血病 串联重复序列 嵌合体 融合基因 -
STR基因分型在葡萄胎及非葡萄胎妊娠流产诊断中的应用
目的 基于短串联重复序列(short tandem repeat,STR)基因分型技术在葡萄胎与非葡萄胎妊娠鉴别诊断中的应用,侧重探讨其在非葡萄胎妊娠诊断中的应用价值及非葡萄胎妊娠的组织学特征.方法 收集北京妇产医院病理科2015年7月至2017年9月临床水肿性流产和/或葡萄胎可疑的流产组织样本656例.应用Simplex OUPTM FFPE DNA组织提取试剂盒提取核酸DNA.基因分型选用PowerPlex 16 HS试剂盒.结果 本研究中成功进行STR分析的有649例,包括葡萄胎妊娠215例和非葡萄胎妊娠434例.非葡萄胎妊娠中二倍体流产占大多数(375例,86.4％),各类三体共计53例(12.2％;包括2?、3?、4?、7?、8?、13?、16?、18?和21?三体),双雌单雄三倍体2例(0.5％),包括4例(0.9％)罕见的单亲同二倍体和单亲异二倍体.对组织形态学疑似葡萄胎的196例样本,经过STR分析得以精确诊断并分型.其中,59例葡萄胎低诊断为二倍体流产,28例二倍体流产过诊断为葡萄胎.将各种类型非葡萄胎妊娠的组织形态学特征与部分性葡萄胎对比分析,发现组织学特征基本无差异;此外,p57kip2蛋白表达在部分性葡萄胎组、三体组及二倍体水肿性流产组中差异无统计学意义(P=0.247).结论 STR分子分型技术解决了非葡萄胎妊娠与早期葡萄胎的鉴别难题,纠正了形态组织学的错误诊断,避免了非葡萄胎妊娠的过诊断问题,并通过分子分型为指导患者的个体化处置方案提供帮助.
关键词： 串联重复序列 葡萄胎 分子分型 三体性 周期素依赖激酶抑制剂p57 -
影响细胞分化相关基因NDRG1作用的相关因素研究进展
N-myc下游调节基因（ N-myc downstream regulated gene ， NDRG）1属于NDRG家族，α／β水解酶超家族，但没有水解酶催化位点［1］。初是在N-myc敲除的小鼠胚胎组织中发现的，受 N-myc 的抑制而得名。 NDRG1位于人类染色体8q24，全长约60 kb，包括16个外显子和15个内含子，含有一个与第1外显子和第1内含子5′端重叠的CpG岛，C末端包含有3段特有的10个亲水性氨基酸残基（ GTRSRSHTSE ）串联重复序列。 NDRG1含有磷酸泛酰巯基乙胺序列，在一些多酶复合物中，该序列提供辅基酰基载体蛋白，作为“摆动臂”活化氨基酸和脂肪酸［2］。
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端粒与Shelterin复合体
端粒是真核细胞线性染色体的末端结构,由简单的DNA串联重复序列和一系列相关的蛋白质组成,在染色体末端形成一个"帽状"结构,对染色体起重要的保护作用,防止出现染色体的断裂、降解与末端融合,与细胞分化、组织再生、DNA修复、细胞的衰老和死亡,以及恶性肿瘤的发生都有着密切的关系.
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炭疽芽胞杆菌基因组中串联重复序列拷贝数的分析
目的 研究炭疽芽胞杆菌基因组中多位点串联重复序列遗传标记的遗传变异规律.方法 根据文献上发表的串联重复序列位点,利用已发表的13对引物,对88株炭疽芽胞杆菌基因组DNA进行PCR扩增,扩增产物进行琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳,利用凝胶影像分析软件对PCR产物DNA片段的碱基含量进行测算,计算出串联重复拷贝数.对部分PCR扩增产物DNA片段进行测序,利用DNAStar软件进行序列比对,分析不同菌株间的串联重复序列遗传变异规律.结果 (1)炭疽芽胞杆菌基因组中的串联重复序列位置,同一菌株具有相对稳定的串联重复拷贝数.(2)88株炭疽芽胞杆菌DNA上的13个串联重复序列遗传标记中,有的串联重复序列拷贝数变异较小,有的却存在着复杂的多态性;(3)有些串联重复序列单位内的核苷酸数目不变,但核苷酸的排列组合有差异,不过其重复单位内都包含着一个相同的稳定不变的核心核苷酸序列.结论 炭疽芽胞杆菌基因组DNA中串联重复序列可以精确定位,测定结果可以数值化,并且串联重复序列在菌株DNA中具有相对的稳定性,因此,串联重复序列是研究炭疽芽胞杆菌遗传特征的较好指标,具有鉴别炭疽芽胞杆菌菌株间差别的能力.
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DNA分子遗传标记RFLP、STR、SNP在凝血因子基因型分析中的应用
血栓性疾病如冠心病、脑梗死、肺栓塞等发生率高、预后较差.其出现与血管内血栓形成密切相关,后者多由凝血因子先天性异常导致并由基因多态性引起.凝血因子的某些基因型决定了患者将终生处于高凝状态,出现血栓.凝血因子基因型与疾病的关系多使用连锁分析,借助遗传标记进行研究,3代遗传标记限制性片段长度多态性(restrict fragment length polymorphism,RFLP)、短串联重复序列(short tandem repeats,STR)、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)为疾病基因定位和疾病诊断提供了有力的工具.本文综述RFLP、STR、SNP在凝血因子基因多态性分析中的应用.
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端粒酶与恶性血液病
肿瘤是一种体细胞遗传病，与遗传物质的改变密切相关，表现为细胞生长失控。因此，人们注意到遗传物质的载体—染色体在肿瘤形成中的改变。而端粒、着丝粒和DNA复制原点是染色体DNA复制的结构三要素。近年来不少学者发现人恶性肿瘤细胞的端粒酶活性不同于正常细胞，揭示端粒酶可能是一广泛的肿瘤标志，在肿瘤的发生发展过程中起重要作用。1 端粒的结构和功能 早在本世纪30年代～40年代，Muller首先提出端粒这一概念，随后Mclinto研究表明，染色体的断端十分活跃而极不稳定，易同其他断端发生断断融合，形成双着丝粒染色体、环状染色体等不稳定形式的染色体。相反，染色体的末端却相当稳定，极少发生端端融合，表明染色体末端具有某种特殊结构将染色体末端封住，使之不能与其他断端融合，这种结构被称为端粒1，2］。端粒是真核细胞线状染色体末端的DNA-蛋白质复合物。端粒的结构特点：①由富含鸟嘌呤碱基G/胞嘧啶碱基C的简单串联重复序列组成，长达数kb(碱基对)，人的端粒DNA重复序列为TTAGGG3］；②端粒的末端并非为平端的双螺旋结构，而是由一条富含G12-16碱基的单链3'端突出［4，5］。端粒的功能：①防止DNA末端降解［6］；②保证染色体的稳定性和功能。2 端粒酶的发现和功能 DNA聚合酶必须在RNA引物参与下按5'-3'方向合成DNA，当RNA引物去除后，即会在新合成的DNA链5'末端留下一个空隙，使端粒缩短，这样势必会导致端粒越来越短，DNA双螺旋结构模型的提出者之一Waston于1972年将其称为末段复制问题提了出来［7］。总之，正常情况下随着细胞的不断分裂，其端粒应该逐渐缩短。但Larson和Spangler等在四膜虫的研究中发现其端粒不见缩短，甚至有所延长，针对这一矛盾，Greider1985年撰文指出，四膜虫DNA端粒的延长不可能是常规DNA聚合酶作用的结果，一定另有原因。后来果然在四膜虫的细胞提取液中发现了一种酶的活性成份，能往富含G的合成寡核苷酸上添加重复序列TTAGGG。这种酶称为末端转移酶或端粒酶［8］。现在我们知道端粒酶是负责染色体末端(端粒)复制，是由RNA和蛋白质组成的核糖蛋白，其中的RNA成份是端粒复制的模板，因此端粒酶又是逆转录酶。人端粒其RNA成份已克隆成功，约含450个核苷酸，模板区为5'-CUAACCCUAAC-3'能指导端粒的合成［9］。端粒酶的功能：①维持端粒长度；②端粒长度、端粒酶活性与细胞生理状态(衰老、恶性生长)有关。
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DNA拷贝数变异及其研究进展
人类基因组变异有多种形式，例如单核苷酸多态性（SNPs）、可变数串联重复序列、转座因子的有无以及结构变异。在基因组中这些变异普遍存在并且广泛分布，个体间表型差异和许多遗传病及一些疾病的易感性被认为是由这些变异造成的。
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脂多糖诱导黏蛋白MUC5AC表达上调机制的研究进展
一、黏蛋白（Mucin，MUC）和脂多糖的生化特性及作用MUC广泛分布于机体各组织黏膜上皮表面，对黏膜起润滑、保护的作用。MUC的分布有组织、器官和细胞特异性。目前已经报道的有20余种[1-4]。MUC是由其多肽基因（Muc gene）编码而成的，根据MUC存在形式的不同可将其分为两类：分泌型和膜结合型。分泌型MUC包括MUC2、MUC5AC、MUC5B、MUC6、MUC7、MUC8、MUC9。其中MUC2、MUC5AC、MUC5B和MUC6位于染色体11p15.5[5]，其结构与人血管性血友病因子（vWF）有很高的一致性，这种结构特点被认为与MUC寡聚化形成凝胶有关。分泌型MUC另一个结构特点是C-半胱氨酸结（CK），此结构可能参与了MUC蛋白单体起始二聚化的过程。膜结合型MUC包括MUC1、MUC3A、MUC3B、MUC4、MUC12、MUC13、MUC16、MUC17和MUC20。这些MUC的共同结构是从氨基末端黏蛋白样结构（串联重复序列）-表皮生长因子（EGF）样区域-N-糖基化区域-第二个EGF样区域-疏水的跨末端及胞质内部的羧基末端。膜结合型MUC通过延伸到细胞表面顶部的外功能区形成保护性黏液凝胶，其胞质尾部含苏氨酸、酪氨酸和丝氨酸的潜在磷酸化位点，可能与增殖、分化和转移有关。
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串联重复信号放大系统检测HBV DNA与其他方法的比较研究
目的探讨TRSE液相杂交法检测HBV DNA的临床应用价值.方法先用TRSE法、斑点杂交法、定性PCR法及荧光定量Taqman PCR法分别检测倍比稀释的标准HBV DNA质粒,比较其敏感性;再用355份血清标本对各个方法的敏感性、特异度、结果的符合率等做进一步的比较分析.结果荧光定量PCR法的敏感性高,达到1.33×104 copy/ml; 普通PCR法的敏感性为5.15 ×104copy/ml;TRSE法的敏感性为8.33 ×104copy/ml较斑点杂交法的6.25 ×105 copy/ml高.在HBsAg +HBeAg阳性组,TRES液相杂交法的阳性率与普通PCR法无差别;在HBsAg (+)/HBeAg (-)组, TRSE液相杂交法只与荧光定量Taqman PCR法有差别.结论 TRSE杂交法能够区分在HBeAg 阳性和阴性组HBV DNA复制的差别;它具有敏感性、特异度高,实用性强等特点,是一种较好的HBV DNA检测方法.
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串联重复序列信号放大液相杂交检测HBV-DNA技术的建立及评价
目的建立串联重复序列信号放大（TRSE）液相杂交系统检测HBV-DNA技术,并初步评价其效果.方法 在前期研究构建的含24个60 bp串联重复核酸片段的重组噬菌粒中,插入4个HBV DNA片段而构建成一级检测探针,并结合12个串联重复的二级放大探针和标记的三级探针,建立检测HBV DNA的TRSE液相杂交系统.采用含HBV全基因组的重组质粒DNA对355份肝炎患者或正常人群的血清样本进行检测,评价该系统的效果.结果 在检测探针的一侧插入HBV DNA片段后,建立了HBV DNA的TRSE液相杂交检测系统.检测含HBV全基因组的重组质粒DNA的敏感性为8.33×104拷贝/ml.检测血清样本时,可区分HBeAg阳性与阴性患者间的HBV DNA水平差异.结论 TRSE液相杂交检测HBV DNA系统具有较好的敏感性、特异性和实用性.串联重复核酸序列信号放大的模式具有进一步开发利用的价值.
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母体血循环中胎儿游离DNA的检测
目的 寻找一种无创性产前基因检测孕妇血浆中胎儿游离DNA的新方法.方法 提取32名健康孕妇血浆标本中胎儿游离DNA,经套式聚合酶链反应(PCR)扩增其性别决定基因(sex-determining region Y,SRY),并引入内参照基因序列ATL1;并采用16个短串联重复序列(short tandem repeat,STR)多态性位点的多重荧光PCR方法对血浆标本中DNA进行STR等位基因扩增.同时,检测孕妇及其丈夫的外周血白细胞DNA,进行基因扫描及对照分析.结果 经SRY-PCR检测发现,17名妊娠男胎孕妇血浆中均出现基因扩增带,其余15名妊娠女胎孕妇中有2名出现假阳性,性别总符合率为94%(30/32).经STR-PCR检测发现,均从孕妇血浆中检测出父源性胎儿DNA的存在.结论 应用孕妇血浆中胎儿DNA作产前诊断准确性较高,是一种无创性产前基因诊断方法,具有广泛的临床应用前景.
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杭州市五家医院万古霉素耐药肠球菌耐药转座子结构及分子分型
目的 明确万古霉素耐药肠球菌(VRE)耐药转座子结构及分子分型.方法 收集2006年4月至2007年4月杭州市5家医院21株VRE菌株,用Etest法进行抗菌药物的药敏试验,并通过PCR、接合试验、质粒提取、耐药转座子结构、脉冲凝胶电泳(PFGE)、多位点序列分型(MIST)及多位点串联重复序列分型(MLVA)进行研究.结果 21株VRE基因型及表型均符合vanA.属于10个不同的PFGE型,7个不同的MLST分型,4个不同的MLVA分型,其中18株属于克隆复合体CC17,另外3株为ST343与CC17接近.所有VRE菌株均对利奈唑胺及替加环素敏感.多对引物对转座子的不同区域的PCR扩增并进行序列拼接、比对,发现其中2株VRE菌株携带典型的耐药转座子Tn1546,其余19株VRE菌株均携带一种新的与Tn1546相似耐药转座子,均在vanXY之间反向插入IS1485.18株VRE菌株均可通过滤膜接合试验进行万古霉素耐药转移,接合菌均含有约54 000 bp大小的质粒.结论 杭州市5家医院21株VRE菌株均为vanA表型及基因型,发现了一种新的万古霉素耐药转座子结构.21株VRE菌株经MLST分型属于7个不同的序列分型,属于或接近易在医院环境里生存并在近年来迅速造成了全球播散的克隆复合体CC17.
