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炭疽毒素及其致病机制的研究进展
炭疽毒素包括水肿毒素( edema toxin,ET)和致死毒素(lethal toxin,LT),是炭疽芽胞杆菌产生的重要致病因子.ET由保护性抗原(protective antigen,PA)和水肿因子(edema factor,EF)组成,LT由PA和致死因子(lethal factor,LF)组成.本文从基因、结构及生物学活性等方面概述了炭疽毒素各组分在炭疽芽胞杆菌致病机制中的作用方式,并阐述了其对炭疽防治措施的科学指导意义.
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内蒙古地区炭疽芽胞杆菌基因单核苷酸多态性研究
目的 研究内蒙古地区炭疽芽胞杆菌基因单核苷酸多态性(SNP)特征.方法 选择内蒙古地区不同分离年代、地点和来源的22株炭疽芽胞杆菌,采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)方法扩增染色体上的13个SNP位点,进行聚类分析.结果 使用的13个SNP位点中8个位点相同,5个位点存在多态性.通过聚类分析,22株炭疽芽胞杆菌可分为4个群,属于A.Br.Aust94亚群和A.Br.008/009亚群的菌株各有1株,A.Br.Ames亚群和A.Br.001/002亚群菌株占大多数.结论 内蒙古地区炭疽芽胞杆菌基因SNP位点具有遗传稳定性,目前5个SNP位点可作为内蒙古地区炭疽杆菌荚膜质粒SNP位点基因分型的指标,A.Br.Ames亚群和A.Br.001/002亚群是内蒙古地区优势亚群.
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CPA恒温扩增技术检测炭疽芽胞杆菌方法的建立
目的 建立一种简便的新型交叉引物恒温核酸扩增结合层析试纸条方法,快速可视化检测炭疽芽胞杆菌核酸.方法 通过序列比对挑选出炭疽芽胞杆菌质粒上的特异性基因pXO2,设计引物、探针并合成标记,建立核酸恒温扩增反应体系,用金标免疫层析试纸条快速检测扩增产物,并测试方法的灵敏度和特异性.结果 建立的核酸恒温扩增结合金标条方法检测炭疽芽胞杆菌,采用阳性质粒DNA优化实验条件,灵敏度可达5.4pg/反应体系;建立的检测方法检测炭疽Sterne疫苗株的灵敏度为6× 103 CFU/ml;与枯草芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌、矮小芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌、蕈状芽胞杆菌等相似菌株无交叉反应.结论 本研究建立的方法对炭疽芽胞杆菌检测具有很好的敏感性、特异性,为生物恐怖因子现场检测提供了新方法,在国境检疫及公共卫生安全领域有较好的应用前景.
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中国炭疽芽胞杆菌荚膜质粒基因单核苷酸多态性研究
目的 研究中国炭疽芽胞杆菌(炭疽杆菌)荚膜质粒基因单核苷酸多态性(SNP)特征.方法 选择中国不同分离年代、地点和来源的95株炭疽杆菌,采用PCR方法扩增荚膜质粒基因上的23个SNP位点,然后进行测序并进行聚类分析.结果 通过聚类分析,95株炭疽杆菌可分为5个群,23个SNP位点中17个位点相同,6个位点存在多态性,其中17.89％(17/95)的菌株与参考菌株Pastuer同源,38.95％(37/95)的菌株与参考菌株Ames Ancestor同源,其余菌株则不同于目前已知的全基因组测序菌株；3株菌在PS-34位点扩增基因片段中缺失长度约80bp的序列,待测的SNP位点包括在该缺失片段中；9株菌株在所有SNP位点扩增阴性,经炭疽杆菌荚膜质粒基因特异引物扩增证实这些菌株缺失荚膜质粒基因.结论 中国炭疽杆菌荚膜质粒SNP位点具有遗传稳定性和自身的特异性,6个SNP位点可作为基因分型的指标.
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中国炭疽芽胞杆菌致死因子基因中单核苷酸多态性位点分析
目的分析中国炭疽芽胞杆菌致死因子基因中的单核苷酸多态性(SNP)位点特征.方法选择18株炭疽芽胞杆菌,采用PCR方法扩增炭疽芽胞杆菌致死因子基因、测序,并进行SNP位点分析.结果实验中所用中国炭疽芽胞杆菌致死因子基因中第895位核苷酸均为G,与国外菌株不同.中国不同地区(包括新疆、广西、北京、内蒙古等地区)、不同年代和不同来源(包括土壤、牛、羊、骡、狗、患者等)分离的菌株,具有相同的SNP位点特征.结论致死因子基因中第895位核苷酸均为G的SNP位点特征很可能是中国炭疽芽胞杆菌的共同特征.
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利用串联重复序列研究炭疽芽胞杆菌的基因分型
目的 应用基因组中多位点串联重复序列遗传标记对不同地区88株炭疽芽胞杆菌进行基因分型.方法 炭疽芽胞杆菌染色体DNA基因组中存在着串联重复序列.在串联重复序列两侧设计引物,PCR扩增,琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳,凝胶影像分析软件对PCR扩增产物碱基含量进行测算,并与测序结果进行比较,计算出串联重复拷贝数,对拷贝数进行聚类分析.结果 (1)聚类分析发现,88株菌株可分为三大群,45个基因型,基因型与生态环境存在一定的关系.就某一地区炭疽暴发而言,其可变数目串联重复序列遗传标记具有相似性.(2)研究发现,A16R疫苗株作为中国的疫苗株具有代表性.结论 炭疽芽胞杆菌基因组中的串联重复序列具有遗传稳定性和特异性,可作为炭疽芽胞杆菌基因分型的指标,在炭疽暴发和生物恐怖事件中的病原体溯源上具有重要的意义.
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等位基因特异性PCR方法检测炭疽芽胞杆菌致死因子基因点突变的评价
目的 建立并评价等位基因特异性聚合酶链反应(PCR)在筛选炭疽芽胞杆菌致死基因点突变中的作用.方法 等位基因特异性PCR方法.结果 等位基因特异性PCR扩增的筛选方法假阳性率较高,其特异性与引物3'端的碱基类型关系不大,与退火温度、模板浓度等均有关系.高保真Taq DNA聚合酶不能改善这种假阳性.结论 等位基因特异性PCR筛选方法影响因素较多,假阳性率高,不适于直接作为点突变的筛选方法.
关键词： 等位基因特异性聚合酶链反应 点突变 炭疽芽胞杆菌 -
炭疽芽胞杆菌致死因子在大肠埃希菌中的表达与纯化
目的 在大肠埃希菌中表达炭疽致死因子,获得纯化蛋白,用于炭疽快速诊断方法以及炭疽致病机制研究.方法 PCR方法扩增炭疽致死因子,构建表达质粒pET-LF,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达,通过Ni离子金属螯合树脂进行纯化,Western blot(WB)试验检查免疫原性,MTT方法检查生物学活性.结果 获得重组炭疽致死因子,WB结果显示重组蛋白具有良好的免疫反应性,MTT方法进行的生物学活性测定表明致死因子与保护性抗原联合,细胞毒性与文献报道相比有明显降低.结论 所获得的重组炭疽致死因子,对于发展炭疽快速诊断方法,以及研究炭疽毒素的作用机制具有一定的促进作用.
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炭疽芽胞杆菌基因组中串联重复序列拷贝数的分析
目的 研究炭疽芽胞杆菌基因组中多位点串联重复序列遗传标记的遗传变异规律.方法 根据文献上发表的串联重复序列位点,利用已发表的13对引物,对88株炭疽芽胞杆菌基因组DNA进行PCR扩增,扩增产物进行琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳,利用凝胶影像分析软件对PCR产物DNA片段的碱基含量进行测算,计算出串联重复拷贝数.对部分PCR扩增产物DNA片段进行测序,利用DNAStar软件进行序列比对,分析不同菌株间的串联重复序列遗传变异规律.结果 (1)炭疽芽胞杆菌基因组中的串联重复序列位置,同一菌株具有相对稳定的串联重复拷贝数.(2)88株炭疽芽胞杆菌DNA上的13个串联重复序列遗传标记中,有的串联重复序列拷贝数变异较小,有的却存在着复杂的多态性;(3)有些串联重复序列单位内的核苷酸数目不变,但核苷酸的排列组合有差异,不过其重复单位内都包含着一个相同的稳定不变的核心核苷酸序列.结论 炭疽芽胞杆菌基因组DNA中串联重复序列可以精确定位,测定结果可以数值化,并且串联重复序列在菌株DNA中具有相对的稳定性,因此,串联重复序列是研究炭疽芽胞杆菌遗传特征的较好指标,具有鉴别炭疽芽胞杆菌菌株间差别的能力.
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氟喹诺酮、大环内酯类、β-内酰胺类等对炭疽菌的体外抗生素后效应
抗生素后效应(PAE)是反映药效学的一个参数,表明了当活性抗菌药物从生长媒介中消除后一个抑制细菌生长的过程.PAE的持久性受细菌种类、抗菌药物的性质和浓度影响,同时也受一些环境因素的影响,如温度、pH、PO2,生长媒介,体液种类等.PAE的临床意义在于指导临床实践中抗菌药物的用药剂量.那些能产生很长PAE的抗菌药物应该将其给药间隔延长,超过其药代参数中的t1/2值.这在保证其有效性的同时,还可减少每日的用药次数,降低药物不良反应的发生率.
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疫区土壤中炭疽芽胞杆菌的分离鉴定及毒力测定
2001年7月24日,锦州某地一村民家的骡子不明原因死亡,事后参加宰杀的村民中发生皮肤炭疽暴发,为了解杀骡场地等周围环境炭疽芽胞杆菌污染情况,我们特对土壤采样进行检测.结果如下.
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炭疽芽胞杆菌A16D2株BA2380基因缺失突变株的构建
本课题组早期研究结果表明,炭疽芽胞杆菌BA2380蛋白可能与炭疽芽胞杆菌毒力有关,因而有必要对其功能进行深入研究.选取炭疽芽胞杆菌A16D2株为出发菌株,以其BA2380基因为目的缺失基因,参照A16D2株基因组序列及质粒pSET4s序列,利用软件设计上下游同源臂及抗性基因引物,用本实验室改造的"Golden Gate"克隆方法将3个片段同时连入温敏型穿梭载体pKMBK中(本实验室构建的受体质粒),从而构建基因打靶质粒.将该基因打靶质粒导入炭疽芽胞杆菌A16D2感受态细胞中,利用同源重组原理,筛选获得炭疽芽胞杆菌A16D2 BA2380基因缺失突变株,并对其进行验证.结果验证了本课题组构建的"Golden Gate"克隆体系进行多片段克隆的高效性,也为后续探索其基因功能奠定了基础.
关键词： 炭疽芽胞杆菌 GoldenGate克隆 基因替换 同源重组 -
环介导等温扩增技术在快速检测炭疽芽胞杆菌中的应用
本文旨在建立适合国境口岸现场应用的生物恐怖防控快速检测方法,从而保障口岸安全.针对生物恐怖炭疽芽胞杆菌,选择目标菌种特异性基因片段,设计引物,运用环介导等温扩增(LAMP)技术建立一套简便、高效的检测方法,并模拟生物恐怖炭疽芽胞杆菌可能存在的基质条件,评价LAMP技术在快速筛查中的适用性.结果显示,LAMP技术排查生物恐怖炭疽芽胞杆菌简便、快速、特异,检测灵敏度为102～103 CFU/ml;且能有效检出在偏酸、偏碱及黏稠基质中的炭疽芽胞杆菌.而高盐环境对该反应影响较大,有必要采用能有效去除盐分的核酸抽提方法.
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脑膜炎奈瑟菌W135菌群和炭疽芽胞杆菌
由于国际旅游业的发展,自2001年1月以来,一种十分少见的脑膜炎双球菌W135菌群引起的化脓性脑脊髓膜炎在很多国家和地区广为流行,而自2001年美国"9.11"恐怖事件后,有关以炭疽杆菌为生物恐怖活动工具的报道一时甚嚣尘上.鉴于这两种菌医院检验科的同行接触不多,本文特将收集到的资料作一简要介绍.1 脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningococcas)W135菌群1.1 所致疾病的近流行情况自2001年初,非洲、欧洲、亚洲很多国家相继报告本菌引起的脑膜炎流行.总死亡率高达10%.如贝宁有7 532人发病,死亡300人;布基纳法索发病10 897人,死亡1 525人;英国至麦加朝圣者中发病41人,死亡11人;沙特阿拉伯发病109人,死亡35人;埃塞俄比亚自该年9月至12月发病391人,死亡37人.其他如乍得、尼日尔、法国、丹麦、挪威、新加坡等国也都有病例报告.
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抗炭疽PA15单克隆抗体的制备及免疫学检测方法的建立
目的:制备抗炭疽保护性抗原15 (protective antigen,PA15)单克隆抗体,初步建立双抗体夹心ELISA检测炭疽感染者血清中的保护性抗原.方法:以纯化的PA63蛋白为免疫原免疫小鼠,利用杂交瘤技术制备单克隆抗体,SDS-PAGE电泳检测抗体纯度,间接ELISA、Western blot、免疫沉淀(IP)和蛋白质谱分析单抗特异性,并建立双抗体夹心ELISA检测方法.结果:制备了2株抗PAl5单克隆抗体,命名为3D7和8E9.SDS-PAGE电泳可见抗体的重链和轻链,间接ELISA、Western blot发现单抗3D7和8E9可与PAl5、PA63特异性结合,IP和蛋白质谱分析发现单抗3D7可与PA83特异性结合,双抗体夹心ELISA方法检测炭疽感染血清中保护性抗原的低检出浓度为16 ng/ml.结论:成功制备了抗PA15单克隆抗体,并建立了双抗体夹心ELISA方法检测炭疽感染血清中的保护性抗原.
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辽宁省炭疽芽胞杆菌 MLVA 分型研究
目的：了解辽宁地区炭疽芽胞杆菌的流行特征及菌型基因特征。方法通过多位点可变数目串联重复序列（Multiple locus variable numbers of tandem repeats analysis ，MLVA）分型实验，对2001—2011年辽宁省分离到的6株炭疽芽胞杆菌分离株DNA进行检测，DNA指纹图谱使用BioNumerics 4．0软件进行统计分析，得出聚类分析结果。结果聚类分析发现，6株炭疽芽胞杆菌株可分为2个基因型。对于炭疽暴发而言，其可变数目串联重复序列遗传标记具有高度相似性。结论炭疽芽胞杆菌基因组中的串联重复序列可作为炭疽芽胞杆菌基因分型的指标，在炭疽暴发事件中的病原体溯源上具有重要的意义。
关键词： 炭疽芽胞杆菌 多位点可变数量串联重复序列分析 基因分型 -
贵州省2006-2011年炭疽芽胞杆菌检出情况与致病性研究
目的 了解贵州省2006-2011年炭疽芽胞杆菌感染和分布情况,为贵州省炭疽疫情的预防控制和炭疽病的分子流行病学研究提供科学依据.方法 对来自贵州省2006-2011年不同地区的830份疑似炭疽标本(外环境标本667份、患者标本151份和牲畜标本12份),采用传统的革兰染色镜检、普通营养琼脂平板和血琼脂平板培养基分离培养炭疽芽胞杆菌,运用青霉素抑制试验和噬菌体裂解试验对可疑炭疽芽胞杆菌菌落进行鉴定.采用Real-time PCR技术检测88株经传统细菌学方法鉴定为炭疽芽胞杆菌菌株pXO1质粒上的PA基因和pXO2质粒上的CAP基因.结果 从830份标本中分离出88株炭疽芽胞杆菌,总检出率为10.60％.2007年分离出炭疽杆菌的阳性标本多,占36.36％;其次为2009年,占29.55％.阳性标本主要分布在黔西南州,其次为毕节地区和黔南州;册亨县、织金县和望谟县为炭疽杆菌检出数较多的监测县.88株炭疽芽胞杆菌CAP基因均为阳性.除2007年2株炭疽菌株PA基因为阴性外,其余86株PA基因均为阳性.结论 贵州省炭疽疫源地面积广大,污染严重;检出的88株炭疽芽胞杆菌中97.73％的菌株同时具有两种毒力质粒,具有强致病性;该研究结果对贵州省炭疽疫情的预防控制及分子流行病学研究具有重要意义.
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应用rLF检测人群血清抗炭疽抗体水平的初步评价
目的 对重组炭疽致死因子(rLF)在人群血清抗体水平检测中的初步应用进行评价.方法 间接ELISA方法检测人群血清特异抗体,检测结果按照抗体相对含量进行分类比较、t检验、S/N比值大于等于2.1的阳性判断标准等多种方法进行统计分析.结果 rLF的检测结果能区别大部分的病人和健康人,实验结果还显示出在我国部分地区的健康人尤其是健康从业人员中也有相当一部分人抗体水平较高,有的甚至达到了感染病人的抗体水平,提示炭疽在我国部分地区有较强隐性感染.结论 致死因子显示出一定的应用潜力,可能用在炭疽的临床诊断、疾病监测、以及用来评估某地区的炭疽流行强度.
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2012-2015年贵州省炭疽芽胞杆菌分离鉴定及MLVA分型分析
目的 了解菌株的分子流行病学特征,为贵州省炭疽疫情的预防控制提供科学依据.方法 对2012-2015年贵州省间不同地区的409份标本(外环境388份、患者19份和牲畜2份)进行炭疽芽胞杆菌分离培养,采用革兰染色镜检、青霉素抑制试验和噬菌体裂解试验对可疑炭疽菌落进行鉴定,分析菌株检出情况.运用MLVA-15技术对炭疽芽胞杆菌分离株进行基因分型获得各VNTR位点的扩增长度并计算重复单元的重复数目.结合各VNTR位点重复数目,利用NTsys 2.10e软件对不同地区菌株进行聚类分析.结果 从409份标本中分离出34株炭疽芽胞杆菌,检出率为8.31％.其中341份土壤检出33株,检出率为9.68％;17份患者皮肤病灶渗出液检出1株,检出率为5.88％.2015年分离出炭疽杆菌的阳性率高,占48.72％(19/39).MLVA-15分析显示,34株菌株被分为3个MLVA型;聚类分析显示,34株菌株被分为A和B两簇,其中A簇又被进一步分为A1和A2分支.来自相同地区或年份的多数菌株聚类关系相对较近.结论 2012-2015年贵州省间各种疑似炭疽送检标本中,土壤的检出阳性率高,贵州省炭疽芽胞杆菌菌株具有MLVA型别多样性,型别分布和聚类关系具有明显的地域性.
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中国炭疽芽胞杆菌中11个串联重复序列位点的特征和分布
目的 检测炭疽芽胞杆菌中可变数量串联重复序列(VNTR)的变化,分析我国菌株中VNTR的特征和分布规律.方法 PCR扩增.琼脂糖电泳和毛细管电泳,测序验证,BLAST比对等.结果 11个VNTR位点中有4个在所有菌株中没有差别,另外7个位点只在个别菌株中检测到差别,有差别的菌株多分布在新疆；11个VNTR位点均位于基因编码区内,编码对细菌生存重要的蛋白和一些功能不明蛋白.结论 结果提示新疆的菌株类型较复杂；本研究中的VNTR位点比较保守,可能不能用于区别不同的炭疽芽胞杆菌,但对于了解炭疽芽胞杆菌的基因组特征以及鉴定炭疽芽胞杆菌具有一定的作用.
关键词： 炭疽芽胞杆菌 可变数量串联重复序列 特征 分布
