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贵州包装饮用水中 污染情况分析
铜绿假单胞菌也称绿脓杆菌，是一种常见的条件致病菌。铜绿假单胞菌在自然界分布广泛，存在于空气、土壤、水体、动物和人皮肤、呼吸道及肠道中。铜绿假单胞菌能够产生溶于水的绿脓菌素、荧光色素、红脓菌素，同时该菌还能够产生内毒素、胞外毒素、外毒素A等十余种致病因子，其中外毒素A为重要的致死因子。在食品检测领域，铜绿假单胞菌是一种非常重要的水源性致病菌，其广泛存在于水源水及各类型包装饮用水中。近年来，随着包装饮用水生产和消费量的不断上升，铜绿假单胞菌污染包装饮用水的报道逐渐增多，甚至引起食物中毒。现阶段，包装饮用水中铜绿假单胞菌污染的问题日益受到重视，包装饮用水中的铜绿假单胞菌已经成为各级监管部门和检测机构重点监测的对象。包装饮用水新国标 GB19298-2014于2015年5月24号正式实施，新国标修改了微生物指标与限量，铜绿假单胞菌被列为必检的微生物检测项目之一。为了掌握新国标实施以来贵州省内生产和销售的包装饮用水中铜绿假单胞菌污染的情况，本文共检测了291个批次的包装饮用水，结果分析如下。
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中国炭疽芽胞杆菌致死因子基因中单核苷酸多态性位点分析
目的分析中国炭疽芽胞杆菌致死因子基因中的单核苷酸多态性(SNP)位点特征.方法选择18株炭疽芽胞杆菌,采用PCR方法扩增炭疽芽胞杆菌致死因子基因、测序,并进行SNP位点分析.结果实验中所用中国炭疽芽胞杆菌致死因子基因中第895位核苷酸均为G,与国外菌株不同.中国不同地区(包括新疆、广西、北京、内蒙古等地区)、不同年代和不同来源(包括土壤、牛、羊、骡、狗、患者等)分离的菌株,具有相同的SNP位点特征.结论致死因子基因中第895位核苷酸均为G的SNP位点特征很可能是中国炭疽芽胞杆菌的共同特征.
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炭疽芽胞杆菌致死因子在大肠埃希菌中的表达与纯化
目的 在大肠埃希菌中表达炭疽致死因子,获得纯化蛋白,用于炭疽快速诊断方法以及炭疽致病机制研究.方法 PCR方法扩增炭疽致死因子,构建表达质粒pET-LF,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达,通过Ni离子金属螯合树脂进行纯化,Western blot(WB)试验检查免疫原性,MTT方法检查生物学活性.结果 获得重组炭疽致死因子,WB结果显示重组蛋白具有良好的免疫反应性,MTT方法进行的生物学活性测定表明致死因子与保护性抗原联合,细胞毒性与文献报道相比有明显降低.结论 所获得的重组炭疽致死因子,对于发展炭疽快速诊断方法,以及研究炭疽毒素的作用机制具有一定的促进作用.
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LFn-PSCA融合蛋白的表达和生物活性研究
目的 研究大肠杆菌中表达的炭疽毒素致死因子氨基端与前列腺干细胞抗原(PSCA)融合蛋白的生物活性.方法 分别扩增炭疽毒素致死因子LF(lethal factor)N端254个氨基酸(LFn)的基因片段和PSCA氨基酸29～100的基因片段,将两片段先后克隆进分泌型载体pAS22中,构建成表达质粒pAS-LFn-PSCA,在大肠杆菌中表达,并对融合蛋白进行纯化和活性检测.结果 实现了融合蛋白LFn-PSCA的分泌型表达.纯化后纯度可达90%以上.体外试验显示LFn-PSCA对小鼠巨噬细胞无毒性,并保留了LFn与保护性抗原结合的活性.结论 在大肠杆菌中实现了LFn-PSCA的分泌型表达,为继续进行以炭疽毒素为载体增强机体免疫应答的研究打下基础.
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炭疽毒素保护性抗原和LFn介导的增强型绿色荧光蛋白进入HeLa细胞的研究
目的 研究炭疽毒素保护性抗原(protective antigen,PA)和致死因子(lethal factor,LF)N端254个氨基酸(LFn)在辅助增强型绿包荧光蛋白(EGFP)进入细胞中的作用.方法 分别扩增炭疽毒素的基因片段和EGFP的基因全长,将两片段先后克隆至pET-21a(+),构建成重组表达质粒pET-LFn-EGFP,在大肠杆菌中诱导表达,并对融合蛋白LFn-EGFP进行纯化.利用荧光共聚焦显微镜和流式细胞术研究LFn-EGFP融合蛋白进入细胞的情况.结果 获得较高纯度的融合蛋白LFn-EGFP,纯度可达90%以上,体外实验显示该融合蛋白保留了LFn与PA结合的活性,并且能够进入到HeLa细胞中.结论 LFn-EGFP蛋白本身也会以未知的机制进入细胞,在PA辅助时,LFn-EGFP进入细胞的效率会有所增加.
关键词： 致死因子 LFn-EGFP融合蛋白 -
炭疽毒素对免疫细胞特异性影响的研究进展
炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)是一种革兰阳性菌,是人兽共患炭疽病的病原体.炭疽毒素是炭疽芽孢杆菌的关键致病因子,是典型的A-B型细菌毒素,其中保护性抗原(protective antigen,PA)是结合亚单位,与靶细胞受体结合;致死因子(lethalfactor,LF)和水肿因子(edema factor,EF)是效应亚单位.
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利用细胞毒性实验检测血液中炭疽毒素致死因子的方法学研究
目的 探索利用炭疽毒素致死因子(lethal factor,LF)的细胞毒性检测血液中LF的可行性,为炭疽的临床检测、治疗及相关研究提供支持.方法 利用小鼠巨噬细胞系J774A.1对LF细胞毒性的高度敏感性,检测血液中LF的浓度,对实验条件进行优化,并利用Fischer 344大鼠模型验证该方法的可行性.结果 细胞毒性实验能够检测到血浆中的LF浓度可低至5 ng/ml,该方法操作简单,灵敏度高,并在大鼠模型中得到了验证,利用本法测定LF在大鼠血液中的半衰期为4.8~6.5 h.结论 初步建立了利用细胞毒性实验检测血液中LF的方法,该方法在灵敏性、经济性和实用性等方面具备一定优势,为炭疽相关研究及临床检测提供了新的选择.
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obiltoxaximab获FDA批准治疗吸入性炭疽
2016年3月FDA批准了Elusys Therapeutics公司一种新的吸入性炭疽治疗药物obiltoxaximab（Anthim）。该药是一种单克隆抗体，与炭疽杆菌（anthrax）产生的毒素结合，抑制毒素与细胞受体的结合，阻止细胞内炭疽致死因子和水肿因子、炭疽毒素的致病作用。其作用机制尚不清楚。与适当的抗菌药联用，可用于成人和儿童的吸入性炭疽热的治疗。该药也可用于预防吸入性炭疽热。治疗前采用苯海拉明预治疗，静脉输注前用生理盐水稀释，输液时间＞90 min。成人推荐剂量为16 mg/kg，体质量＜40 kg者参阅说明书；儿童体质量＞40 kg剂量为6 mg/kg，15～40 kg为24 mg/kg，≤15kg为32 mg/kg。
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炭疽毒素小分子抑制剂
炭疽病是由炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)引起的恶性传染病,炭疽菌进入宿主后产生的炭疽毒素是感染者致死的主要原因.炭疽毒素含有2种具有酶催化活性的蛋白质——致死因子和水肿因子,以及1种共同的结合和转运蛋白质——炭疽保护性抗原,炭疽保护性抗原分别与上述两种因子组成致死毒素和水肿毒素.现阶段治疗炭疽病的主要药物为抗生素,但抗生素只能杀灭人体组织内的部分炭疽热孢子和细菌,不能抵抗孢子和细菌在体内产生的毒素,因而需要开发抑制炭疽毒素的新型药物.本文主要综述近年来国际上对靶向保护性抗原、致死因子和水肿因子的炭疽毒素小分子抑制剂的主要研究进展.
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炭疽杆菌的致病因子与炭疽的防治
炭疽为一种人、兽共患急性传染病,部分国家将炭疽杆菌作为生物威胁因子进行研究和生产.该菌毒性与质粒PXO1、PXO2有关,PXO1产物包括水肿因子、保护性抗原和致死因子.PXO2是另一编码致病因子,产物英膜抑制细胞的吞噬,有助病菌繁殖、扩散和建立感染.抗生素与抗炭疽血清联合应用,突变保护性抗原、水肿因子、致死因子联合注射,Al(OH)3佐剂PA疫苗,减毒口服菌苗,PA基因重组活菌苗均可抵抗炭疽杆菌致死性攻击.
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长效炭疽疫苗
据报道,Vical 公司正在研制一种DNA炭疽疫苗,该疫苗为二联疫苗,由表达炭疽杆菌保护性抗原及致死因子的灭活形式的两种质粒组成.动物实验表明,该疫苗在家兔身上可以引起有效的免疫反应,并为家兔提供长期的保护作用,使其经受住致死剂量的雾化炭疽杆菌孢子的攻击.
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炭疽杆菌致死因子LF253的制备及活性分析
目的:制备具有生物学活性的重组致死因子253 (lethal factor 253,LF253)抗原,获得纯化的目的蛋白,检测其与全分子致死因子(lethal focfor,LF)蛋白竞争性结合保护性抗原(protective antigen,PA)的能力.方法:PCR扩增致死因子LF253片段的DNA,将目的基因插入pET-28a(+)表达载体中,利用大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主菌,IPTG诱导重组蛋白表达,通过His标签亲和层析柱获得目的蛋白,Western blot和ELISA法检测蛋白抗原性,Biacore T-100测定重组蛋白与保护性抗原PA结合的亲和力,细胞毒性实验检测其生物学活性.结果:成功构建原核表达载体pET-28a/LF253,诱导获得重组蛋白sLF253的表达.Western blot和ELISA检测结果证实,该重组蛋白具有良好抗原特异性;细胞毒实验结果表明,重组蛋白可在体内外中和致死毒素引起的生物学效应.结论:本研究制备的融合蛋白sLF253能够与保护性抗原PA结合,可竞争性抑制LF全分子蛋白与PA的聚合,阻断炭疽毒素的致死作用,为今后炭疽疫苗等药物的研发奠定了基础.
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应用rLF检测人群血清抗炭疽抗体水平的初步评价
目的 对重组炭疽致死因子(rLF)在人群血清抗体水平检测中的初步应用进行评价.方法 间接ELISA方法检测人群血清特异抗体,检测结果按照抗体相对含量进行分类比较、t检验、S/N比值大于等于2.1的阳性判断标准等多种方法进行统计分析.结果 rLF的检测结果能区别大部分的病人和健康人,实验结果还显示出在我国部分地区的健康人尤其是健康从业人员中也有相当一部分人抗体水平较高,有的甚至达到了感染病人的抗体水平,提示炭疽在我国部分地区有较强隐性感染.结论 致死因子显示出一定的应用潜力,可能用在炭疽的临床诊断、疾病监测、以及用来评估某地区的炭疽流行强度.
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炭疽杆菌致死因子的克隆与表达
以炭疽杆菌A16R株基因组DNA为模板,PCR扩增出炭疽杆菌致死因子LF基因.构建pET-28(a)/LF表达质粒,并在大肠杆菌中表达.优化表达条件,可溶性目的蛋白表达量约占细菌可溶性总蛋白的10%,表达产物经疏水层析纯化后,目的蛋白约占90%.免疫双扩散及免疫印迹试验检测结果显示,该表达产物与炭疽杆菌诊断血清有特异性反应,具有抗原性.
